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人乳腺癌姿杉醇耐藥株細胞

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應用領域醫療衛生,環保,化工,生物產業,農業

人乳腺癌姿杉醇耐藥株細胞

1.試劑和溶液

乙醇: 無水乙醇,95%乙醇,85%乙醇,70%乙醇

抗原修復液: 0.01M的檸檬酸鈉緩沖液:58.82g檸檬酸三鈉及7.56g檸檬酸溶于200ml純水,調pH至 6.0,純水1:100稀釋為工作液

3%過氧化氫-甲醇: 30%的過氧化氫與無水甲醇1:9稀釋

10X PBS: 80g NaCl,2g KCl, 14.4g Na2HPO4 和2.4g KH2PO4 加1 L純水,調pH至 7.4

洗滌液: 1×PBS:純水稀釋10× PBS;1× PBST:含0.05% Tween-20 的1×PBS(1×PBST)super block,生物素標記的UltraTekAnti-Polyvalent二抗,酶標親和素UltraTek HRP,DAB

顯色試劑盒:Cat. KT1002a

抗體稀釋液:3%BSA-PBS

0.5%鹽酸-乙醇:0.5~1%鹽酸,95.0~95.5%乙醇

蘇木素:蘇木精2g溶于250ml無水乙醇,十六水合硫酸鋁17.6g 溶與750ml純水,以上溶液充分混合,加入碘酸鈉 0.2g和冰醋酸20ml

人乳腺癌姿杉醇耐藥株細胞

2.實驗步驟

1組織固定:烘箱溫度65-75℃ 30min或者65℃隔夜;

2脫蠟:二甲苯浸泡三次,每次10分鐘;

3水化:依次經過無水乙醇,95%乙醇,85%乙醇,70%乙醇浸泡,每次5min;

4洗滌:自來水沖洗1次,PBS浸泡3min;

5抗原修復:放入稀釋100倍的檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0) 中,高壓鍋煮沸10min,常溫冷卻30min;

6洗滌:純水浸泡2次,PBS浸泡1次,每次3min;

7滅活酶:室溫下3%過氧化氫-甲醇暗處處理切片15min;

8洗滌:純水浸泡1次,PBS浸泡2次,每次3min;

9封閉:加入適當體積的super block(KT1002a Reagent A),37℃溫箱孵育5min;

10洗滌:純水浸泡1次,PBS浸泡2次,每次3min;

11一抗:加入反應體積為0.15ml,適合濃度的一抗, 37℃ 濕盒孵育60min。

12洗滌:PBST浸泡3次,PBS浸泡1次,每次3min;

13加入適當體積生物素標記的UltraTek Anti-Polyvalent的二抗(KT1002a Reagent B),37℃濕盒孵育10min;

14洗滌:PBST浸泡3次,PBS浸泡1次,每次3min;

15加入適當體積酶標親和素UltraTek HRP(KT1002a Reagent C), 37℃濕盒孵育10min;

16洗滌:PBST浸泡3次,PBS浸泡1次,每次3min;

17顯色:滴加適量DAB顯色液(KT1003a)至切片上,室溫顯色1~5min,自來水沖洗;

18復染:蘇木素染色5min,蒸餾水沖洗5min;

19分化: 0.5%鹽酸乙醇混合液中分化,自來水沖洗3-4次, PBS中浸泡10-20秒返藍,自來水沖洗2次。

20脫水:經過70%乙醇,85%乙醇,95%乙醇,無水乙醇浸泡,每次5min;

21透明:二甲苯浸泡2次,每次10-15min;

22封片:晾干后加中性樹膠,蓋玻片封片;

23結果:顯微鏡觀察,記錄結果。

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