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小鼠胚胎成纖細胞

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應用領域醫療衛生,環保,化工,生物產業,農業

小鼠胚胎成纖細胞細胞培養步驟

一.培養基及培養凍存條件準備:

1) 準備DMEM(iCell-128-0001)培養;小牛血清,10%;Glutamax,1%;NEAA(Non-essential Amino Acids),1%;雙抗,1%。

2) 培養條件: 氣相:空氣,95%;二氧化碳,5%。 溫度:37攝氏度,培養箱濕度為70%-80%。

3) 凍存液:90%血清,10%DMSO,現用現配。

注意事項:

1. 該細胞起始接種密度應在3000/平方厘米,并且在細胞達到80%融合或者密度介于5萬-6萬/平方厘米時傳代,避免細胞*融合。

2. 冷凍細胞在復蘇后有些漂浮的細胞有可能是存活的,應通過溫和離心收集并繼續培養。

3. 細胞內空泡通常是細胞受到壓力的表現,原因可能是培養基中缺乏谷氨酰胺、添加抗真菌劑、不適當的CO2環境對培養基中碳酸氫鈉濃度或培養基的營養消耗殆盡。一般來說,對于某些細胞系,尤其是向3T3-L1這樣具有脂滴的細胞,細胞包含空泡是正常的。

4. 大部分品牌的DMEM含有較高濃度的碳酸氫鈉(3.7g/L),培養細胞時需要提高CO2濃度(7%-10%)。

二. 細胞處理:

1) 復蘇細胞:將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,加入4mL培養基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘,棄去上清液,補加1-2mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養瓶中培養過夜(或將細胞懸液加入250px皿中,加入約8ml培養基,培養過夜)。第二天換液并檢查細胞密度。

2) 細胞傳代:如果細胞密度達80%-90%,即可進行傳代培養。

小鼠胚胎成纖細胞對于貼壁細胞,傳代可參考以下方法:

1. 棄去培養上清,用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2. 加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養瓶中,置于37℃培養箱中消化1-2分鐘,然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,若細胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺,輕敲幾下培養瓶后加2ml*培養基終止消化。

3. 按6-8ml/瓶補加培養基,輕輕打勻后吸出,在1000RPM條件下離心4分鐘,棄去上清液,補加1-2mL培養液后吹勻。

4 . 收到細胞后*傳代推薦將細胞懸液按1:2的比例分到新的含6ml培養基的新皿中或者瓶中,建議客戶凍存一支備用,后續傳代根據實際情況按1:2到1:5的比例進行。

3)細胞凍存:待細胞生長狀態良好時,可進行細胞凍存。

下面T25瓶為例;

1.細胞凍存時,棄去培養基后,PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶,細胞變圓脫落后,加入2ml*培養基終止消化,可使用血球計數板計數。

2.1000rpm離心4min去掉上清。用血清重懸浮,加DMSO至終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻,按每1ml的數量分配到凍存管中,注意凍存管做好標識。本公司按每個凍存管細胞數目大于1X106個細胞凍存。

3.將凍存管置于程序降溫盒中,放入-80度冰箱,至少2個小時以后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

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