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熒光定量的引物設計原則是什么?

更新時間:2018-10-30瀏覽:955次

   熒光定量早已是各個分子生物學實驗室常用的簡單的實驗技術。十年的變化很大。伴隨著測序成本的降低和科研經費支持的增加,熒光定量實驗天天都做,天天都要處理和分析數據。

  熒光定量技術已經很普遍,但對于接觸它的人來說,總會遇到一些這樣那樣大大小小的問題,這些熒光定量實驗中(染料法)的一些小技巧,相信你能用得上,助在PCR的路上一帆風順,少走彎路。
  熒光定量是一種在DNA擴增反應中,以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應(PCR)循環后產物總量的方法。通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。
  熒光定量是實驗室常用的實驗。研究基因在mRNA表達水平,以及驗證基因敲除后下游靶基因變化情況等等。
  熒光定量的引物設計原則:
  (1)引物長度一般在15~30堿基之間,過長會導致其延伸溫度大于74℃,不適于TaqDNA聚合酶進行反應。
  (2)引物GC含量在40%~60%之間,Tm值接近72℃。引物的Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度,一般計算公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估計引物的Tm值。
  (3)引物應具有特異性。引物設計完成以后,應對其進行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性,就可以進行下一步的實驗了。
  (4)引物自身及引物之間不應存在互補序列。引物自身不應存在互補序列,否則引物自身會折疊成發夾結構使引物本身復性。
  (5)引物擴增長度:一般RT-PCR引物擴增長度在100-200bp。
  

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