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如何高效又穩定的構建干細胞疾病模型?

更新時間:2019-12-14瀏覽:1166次

為什么多能干細胞大有前途?

      人類多能干細胞具有自我更新能力并且具有分化成為任何細胞類型的潛力,幫助克服現有動物模型中對某些疾病的限制。雖然動物模型長久以來被用于研究疾病的不同發育階段,但該類模型并不完美,比如,動物模型心臟的尺寸以及靜息心率與人類有很大的差異,在一些情況下某些疾病的表型可能是無法準確呈現。

 

        此外,病人來源的人類細胞的培養雖也逐漸被用于科學研究以及醫療發展。但是從病人血液或者組織中分離得到的這些細胞系很難持續的培養,同時特定的細胞系也很難從中分離得到。

 

        人類多能干細胞(Pluripotent stem cells,PSCs)恰恰改變了以上困境。PSCs來源于正常的原代細胞,具有無限自我更新的能力,可通過誘導獲得特定的細胞類型。誘導多能干細胞(iPSCs)越來越多地被用于人類疾病模型的研究,為疾病模型的建立及其在藥物篩選中的應用創造了新的可能性。此外,結合CRIPSR-Cas9等基因編輯技術,還能夠在iPSCs疾病模型中引入或糾正疾病相關的突變,從而研究突變對疾病表型的影響。

 

     基于iPSC構建疾病模型的流程基于iPSC構建疾病模型的步驟包括體細胞重編程為hiPSC、通過基因組編輯產生基因對(包括對照和突變的hiPSCs)、hiPSCs細胞系的克隆和鑒定、hiPSCs細胞系的分化以及疾病模型的可視化。

 

        基于iPSC構建相關疾病模型及研究進展帕金森癥是一種在中老年中常見的神經退行性疾病,主要生理學癥狀是多巴胺能神經元的丟失、α-突觸核蛋白的聚集、路易氏體的出現。現有的帕金森癥治療僅針對疾病的癥狀,不能治愈或延緩病情發展。為尋找到更有效、確的靶點,一個全面且準確的帕金森癥模型變得異常重要。一般而言,遺傳小鼠模型不能代表患者中觀察到的病理生理神經退行性變和蛋白聚集模式。另一方面,局部或系統給予神經毒素的帕金森癥動物模型雖成功地復制了多巴胺能神經元的神經退行性變化,但它們不能以緩慢、漸進的方式再現退行性病變,也不能形成在病人病理中出現的路易氏體。

 

       利用細胞重編程和基因編輯技術,可從患者體細胞中產生疾病特異性的iPSC,有助于了解功能相關性的分子發現和個人遺傳變異等。2020年The New England journal of Medicine雜志上發表文章題為《Personalized iPSC-Derived Dopamine Progenitor Cells for Parkinson's Disease》,報道了從自體誘導多能干細胞分化的中腦多巴胺能祖細胞植入特發性帕金森病患者體內產生的緩解帕金森癥的研究。

 

         患者特異性祖細胞是在良好的制造條件下產生的,并具有黑質致密部神經元的表型特性;在人源化小鼠模型的實驗中表明,這些特異性的祖細胞缺乏免疫原性,當被植入帕金森癥病患者的殼核,不需要進行免疫抑制。帕金森癥的臨床癥狀在誘導的特異性祖細胞植入后18到24個月穩定或改善。因此,利用iPSC在臨床方面緩解帕金森癥已經初見曙光。

 

    誘導多能干細胞的技術除了用于建立帕金森癥的模型之外,還在多種疾病的模型建立以及科學研究過程中發揮著關鍵作用。比如誘導多能干細胞來源的心肌細胞模型可用于研究心肌細胞的功能和功能障礙、藥物篩選和毒性、以及心臟病新藥的開發。

 

除此之外,誘導多能干細胞還廣泛用于建立表征不同3D結構的組織和類器官(Organoid)。比如2013年Nature發表論文題為《Cerebral organoids model human brain development and microcephaly》,開發出了人類誘導多能干細胞的衍生的3D器官培養系統,利用該類器官模型,研究人員使用RNA干擾和患者特異性誘導的多能干細胞來模擬小頭癥(Microcephaly)患者,是一種很難在小鼠身上進行重現的疾病,并證明了患者器官樣體中神經元的過早分化缺陷可以幫助解釋疾病的表型。總的來說,誘導多能干細胞在復雜的人體組織中衍生的三維類器官也能再現發育過程和疾病特征。

     但誘導多能干細胞建立相關疾病模型也并非完美方案。如何將患者來源的細胞準確分化為目標細胞、如何建立背景類似的對照組、防止本身遺傳背景對于一些關鍵表型的掩蓋作用,以及重編程的效率和表觀遺傳的特征,都是研究者未來需要考慮的。沒有一項技術是完美的,但誘導多能干細胞模型的建立大大擴展了我們精細模擬疾病發生發展的過程以及對藥物篩選和鑒定使用范圍,為未來開發相應疾病的治療方案和臨床藥物提供了重要工具。

細胞重編程:

     該系統基于復制缺陷型仙臺病毒(SeV)的載體,安全且高效地導入并表達一些關鍵的遺傳基因,它們是將體細胞重編程為iPSC所必需的。多種細胞經驗證,如成纖維細胞、PBMCs、CD34+細胞、T細胞、微血管內皮細胞、尿細胞、羊水細胞、骨骼肌成肌細胞等。此外,CTS™ CytoTune-iPS 2.1 仙臺病毒重編程試劑盒—無縫轉移至臨床培養。

細胞改造: 

       使用Neon轉染系統進行電穿孔或使用Invitrogen Lipofectamine 干細胞轉染試劑進行脂質轉染,將編輯工具遞送到iPSC中。雖然這兩種方法都能成功完成基因組編輯,但電穿孔遞送基因編輯工具通常編輯效率更高。

 細胞培養:

 單細胞分選hiPSC需要穩定的培養基,既可培養單個hiPSC且適用于hiPSC擴增培養,同時無需每天換液。

 細胞鑒定:

       畸胎瘤形成是證明hiPSC細胞系多能性的方法之一,但這一過程過于漫長且需要動物實驗。在基因表達分析中使用從hiPSC和擬胚體(一種從hiPSC產生所有三個胚層的無偏差方法)分離的mRNA,可通過檢測hiPSC中是否存在多能性基因及擬胚體中是否存在胚層基因,驗證多能性。除此之外,您也選擇使用PluriTest檢測和KaryoStat檢測。

 

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