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co-IP實驗

更新時間:2019-12-10瀏覽:2233次

由于co-IP相對問題較多,以co-IP為例進行介紹。

 Step 1固定抗體

 

Step 2加樣

 

Step 3結合,去除非特異性蛋白

 

Step 4靶蛋白(紅色)洗脫或者互作蛋白復合物(紅色+黃色)洗脫

 

 

Step 5分析檢測—Western Blot或者質譜

常用“黑話”

 

 上圖證明了EDR1和EDR4有相互作用。如果想要設計好實驗,讓我們先弄清以下“黑話”的意思吧。

陽性對照:證實細胞裂解物中確實存在靶蛋白(IP)或者互作蛋白對(co-IP,比如誘餌蛋白X和靶蛋白Y),即為常說的input。可直接取抽好的蛋白溶液進行Western。

陰性對照:用來排除假陽性。IP/co-IP 后靶蛋白或者互作蛋白對都檢測到了,固然是值得高興的,但是這結果是不是假陽性呢?還得做個陰性對照。陰性對照如何設置呢?考慮到整個實驗體系會出現beads、抗X抗體、誘餌蛋白X、靶蛋白Y(co-IP):

 

 *注意:總蛋白上樣量過多也會造成 非特異性結合,建議上樣量為500ug-1mg。上樣之前一定要先用BCA定個量!定個量!定個量!

 

pre-clear:上樣前先用裂解液過一遍柱子,減少基質本身對蛋白的吸附。

 

Output:在某些co-IP實驗中,實驗人員會把IP后的上清分別進行誘餌蛋白X和靶蛋白Y的WB檢測,該對照組稱為output組。

 

內源性co-IP實驗,如果終結果為陽性,則可以證明兩個蛋白之間存在相互作用;但是結果為陰性,是否兩個蛋白就一定不發生相互作用了了呢?也不一定。有可能是兩個蛋白是弱相互作用力,這時候可能需要交聯劑協助,鎖定強化弱互作蛋白;也有可能是內源蛋白表達量低,可先做過表達co-IP作為對照。

 

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