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細胞凍存步驟的專業實驗流程

更新時間:2019-05-06瀏覽:2164次

 我們知道,在細胞培養 檢測實驗在實驗儀器、培養基等等工作上都要耗費不少的人力和體力。好在很久以前就有高人發明了細胞保存這個實驗步驟,將暫時多出來的細胞冰凍保存,以極大程度保存細胞活力。

一、細胞冷凍保存

1. 材料:

生長良好之培養細胞、新鮮培養基、DMSO (Sigma D-2650)、無菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020)0. 4%(w/v)trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球計數盤與蓋玻片、等速降溫機(KRYO10SeriesII)

2. 冷凍保存方法:

(1)傳統方法: 冷存管置于4 10分鐘--->-20 30分鐘--->-80 1618小時(或隔夜)--->液氮槽vaporphase長期儲存。

-20 不可超過1小時,以防止胞內冰晶過大,造成細胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80 冰箱中,惟存活率稍微降低一些。

(2)程序降溫:利用已設定程序的等速降溫機以-1-3 /分鐘之速度由室溫降至(-80 以下)-120 ,再放在液氮槽vaporphase長期儲存。適用于懸浮型細胞與hybridoma之保存。

3. 步驟:

(1)冷凍前24-48小時更換半量或全量培養基,使細胞處于指數生長期。

(2)配制冷凍保存溶液(使用前配制):另取一離心管,加入培養基、血清,逐滴加入二甲基亞砜 (DMSO)20%濃度,即制成雙倍的凍存液,置于室溫下待用。

(3)離心收集培養之細胞,用加血清的培養基重懸起細胞,取少量細胞懸浮液(0. 1 ml)計數細胞濃度及凍前存活率。

(4)取與細胞懸液等量的凍存液,緩慢逐滴加入細胞懸液,并晃動試管,制成細胞凍存懸液(DMSO后濃度為510%),使細胞濃度為15×106cells/ ml,混合均勻,分裝于已標示*之冷凍保存管中,12 ml/vial,并取少量細胞懸浮液作污染檢測。嚴密封口后,注明細胞名稱、代數、日期。然后進行凍存。

4. 注意事項:

(1)欲冷凍保存之細胞應在生長良好(logphase)且存活率高之狀態,約為8090%致密度。冷凍前檢測細胞是否仍保有其*性質,例如hybridoma應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產生。

(2)細胞在液氮中可長期凍存無*,而不會影響細胞活力;-70度可保存數月。

(3)注意冷凍保護劑之品質。DMSO應為試劑級等級,無菌且無色(0. 22micron FGLP TeIflon過濾或是直接購買無菌產品,如Sigma D-2650),以510 ml小體積分裝,4 避光保存,勿作多次解凍。Glycerol亦應為試劑級等級,以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內使用,因長期儲存后對細胞會有毒性。本方法中先制備雙倍凍存液,可避免DMSO直接加入時釋放的熱量對細胞的損傷。緩慢逐滴加入細胞懸液是使細胞逐步適應高滲,可降低細胞受損。DMSO可能引起部分白血病細胞株的分化,可換用10%甘油凍存。

(4)冷凍保存之細胞濃度:

normal human fibroblast:13×106cells/ ml

hybridoma:13×106cells/ ml,細胞濃度不要太高,某些hybridoma會因冷凍濃度太高而在解凍24小時后凋亡。

adherent tumor lines:57×106,依細胞種類而異。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度,而HeLa只需13×106cells/ ml

other suspensions:510×106cells/ mlhuman lymphocyte須至少5×106cells/ ml

(5)冷凍保護劑濃度為510%DMSO,若是不確定細胞之冷凍條件,在做冷凍保存之同時,亦應作一個backup culture,以防止冷凍失敗。

(6)凍存可用10%90%的血清,一般高濃度血清有助于維護細胞活力,此處介紹20%終濃度有利于細胞懸浮而少沉積(4度時),復蘇存活率在80%90%以上,對原代培養細胞,以90%血清凍存更為有效。

二、冷凍細胞活化

1. 冷凍細胞之活化原則為快速解凍,以避免冰晶重新結晶而對細胞造成傷害,導致細胞之死亡。

2. 細胞活化后,約需數日,或繼代一至二代,其細胞生長或特性表現才會恢復正常(例如產生單株抗體或是其它蛋白質)

3. 材料

37 恒溫水槽、新鮮培養基、無菌吸管/離心管/培養瓶、液氮或干冰容器

4. 步驟:

(1)操作人員應戴防護面罩及手套,防止冷凍管可能爆裂之傷害。

(2)自液氮或干冰容器中取出冷凍管,檢查蓋子是否旋緊,由于熱脹冷縮過程,此時蓋子易松掉。

(3)將新鮮培養基置于37 水槽中回溫,回溫后噴以70%酒精并擦拭之,移入無菌操作臺內。

(4)取出冷凍管,立即放入37 水槽中快速解凍,輕搖冷凍管使其在1分鐘內全部融化,以70%酒精擦拭保存管外部,移入無菌操作臺內。

(5)取出解凍之細胞懸浮液,緩緩加入有培養基之培養容器內(稀釋比例為1:101:15),混合均勻,放入CO2培養箱培養。取0. 1 ml解凍細胞懸浮液作存活測試。

(6)解凍后是否立即去除冷凍保護劑(例如DMSOglycerol),依細胞種類而異,一般而言,大都不需要立即去除冷凍保護劑。惟若要立即去除,則將解凍之細胞懸浮液加入含有5-10 ml培養基之離心管內,離心1000 rpm5分鐘,移去上清液,加入新鮮培養基,混合均勻,放入CO2培養箱培養。

(7)若不需立即去除冷凍保存劑,則在解凍培養后隔日更換培養基。

三、細胞計數與存活測試

1. 原理:

(1)計算細胞數目可用血球計數盤或是Coultercounter粒子計數器自動計數。

(2)血球計數盤一般有二個chambers,每個chamber中細刻91 mm2大正方形,其中4個角落之正方形再細刻16個小格,深度均為0. 1 mm。當chamber上方蓋上蓋玻片后,每個大正方形之體積為1 mm2×0. 1 mm=1. 0x10-4 ml。使用時,計數每個大正方形內之細胞數目,乘以稀釋倍數,再乘以104,即為每 ml中之細胞數目。

(3)存活測試之步驟為dyeexclusion,利用染料會滲入死細胞中而呈色,而活細胞因細胞膜完整,染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍色之trypan blue染料,如果細胞不易吸收trypan blue,則用紅色之Erythrosin bluish。計算細胞活率:活細胞數/(活細胞數+死細胞數)×100%。計數應在臺盼蘭染色后數分鐘內完成,隨時間延長,部分活細胞也開始攝取染料;因為臺盼蘭對蛋白質有很強的親和力,用不含血清的稀釋液,可以使染色計數更為準確。

2. 材料:

0. 4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061);Erythosin bluish stain;0. 1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)0. 05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100 mlCa++/Mg++freesaline;血球計數盤及蓋玻片(Hemocytometerandcoverslip);計數器(counter);低倍倒立顯微鏡;粒子計數器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白細胞稀釋液(4%乙酸溶液)

3. 步驟:

(1)50 μl細胞懸浮液與50 μl trypan blue(orErythrosinbluish)等體積混合均勻于1. 5 ml小離心管中。

(2)取少許混合液(15 μl)自血球計數盤chamber上方凹槽加入,蓋上蓋玻片,于100倍倒立顯微鏡下觀察,活細胞不染色,死細胞則為藍色(或紅色-Erythrosin bluish)

(3)計數四個大方格之細胞總數,再除4,乘以稀釋倍數(至少乘以2,因與trypanblue等體積混合),后乘以104,即為每 ml中細胞懸浮液之細胞數。若細胞位于線上,只計上線與右線之細胞(或計下線與左線之細胞)

注:4大格細胞總數×稀釋倍數×104/4=細胞數/ ml;每一大格的體積=0. 1 cm×0. 1 cm×0. 01 cm=10-4 ml

計數板計數時,適濃度為510×105細胞/ ml,此范圍外計數誤差偏大。高濃度細胞懸液,可取出部分作稀釋或連續稀釋后計數。

4. 范例:

T75 monolayer culture制成10 ml細胞懸浮液,取0. 1 ml溶液與0. 1 ml trypan blue混合均勻于試管中,取少許混合液加入血球計數盤,計數四大方格內之細胞數目。

活細胞數/方格:55624959;死細胞數/方格:5346;細胞總數=243

平均細胞數/方格=60. 75;稀釋倍數=2;

細胞數/ ml60. 75×104×2(稀釋倍數)=1. 22×106;

細胞數/flask(10 ml)1. 22×106×10 ml=12. 2×106

其實理論上講處于細胞增殖期之前的細胞都可用于凍存,不過如果想要更好的效果,還得取對數生長期的細胞,并注意做好凍存前的換液工作。溫馨提示,從凍存管將細胞放入或取出時,都好做好保護工作,以免受凍。

 

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