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解析LncRNA調控腫瘤糖酵解重編程的作用及機制

更新時間:2019-04-17瀏覽:2270次

1 AGPG被鑒定為作為代謝相關的LncRNA

為了發現對ESCC發育有顯著影響的致癌LncRNA,我們首先從腫瘤基因組圖譜(TCGA)數據庫中鑒定出在ESCC組織中表達高于成對相鄰正常組織的LncRNA。然后,我們根據log2差異倍數對這些LncRNA進行分類。接下來,我們建立了一個siRNA庫,對于siRNA進行篩選,這些siRNAs還包含了TARGETplus上的專有雙鏈化學修飾,以確保zui佳的鏈負載和干擾類似microRNA的種子活性,從而減少非目標效應。為了確定可能改變葡萄糖代謝的LncRNA,我們將siRNA文庫轉染到兩個人ESCC細胞中,檢測細胞活力和乳酸生成。我們發現14LncRNA可能是細胞增殖所必需的,10個參與乳酸的產生,8個可能參與細胞活力和葡萄糖代謝(圖1a)。在這8個低分子RNA中,AGPG基因敲除顯著降低了細胞活力和乳酸生成(圖1b)。生物信息學分析顯示,AGPG位于染色體1q32.1上,有3個外顯子(1-5610447-1052611304-13488)。我們關注的是AC098934.2-201亞型,為了簡單起見,我們將該亞型稱為AGPG。然后,我們在人食管鱗癌細胞和正常食管上皮細胞(Het-1ANE-1)中驗證了AGPG的表達shui平,我們發現腫瘤細胞的AGPGshui平明顯高于正常細胞,ESCC細胞的AGPG拷貝數也增加(圖1c,d),AGPG在其他ESCC細胞系中對細胞增殖和分泌乳酸的作用也得到進一步證實。

2 AGPG的表達與食管鱗癌預后的關系

 

與我們的生物信息學分析結果(圖1e)一致,我們發現高AGPGshui平與ESCC患者的不利總體生存率相關(圖1f)。與中值相比,我們將基因表達分為低表達或高表達:如果表達shui平高于中值,則將其分為高表達,而如果低于中值,則將其分為低表達。多因素分析也表明AGPGESCC患者的獨立預后因素。根據TCGA數據庫分析,AGPG在多種癌癥中高表達,包括胃癌(GC)、結直腸癌(CRC)、肝癌、乳腺癌和肺癌。但在多形性膠質母細胞瘤(GBM)、頭頸部鱗狀細胞癌、甲狀腺癌等腫瘤組織中,其表達與正常組織無明顯差異。此外,在腎嫌色細胞癌、腎透明細胞癌和腎乳頭狀細胞癌中,AGPGshui平也降低。與許多其他LncRNA類似,AGPG在不同癌癥中具有組織特異性表達模式。接下來,我們進行qRT-PCRRNAScope原位雜交(ISH)檢測AGPGESCCGCCRC組織中的表達。我們的結果顯示AGPGESCCGCCRC組織中高度表達(圖1g-i)。這些結果提示AGPG的失調與癌癥的發展有著密切的關系。為了確定AGPG的亞細胞定位,我們用qRT-PCR方法檢測了AGPG在胞質和細胞核中的表達。結果表明,AGPG主要定位于細胞核,部分定位于細胞質,RNAScope-ISHRNA熒光原位雜交進一步證實了這一點(圖1j-l,補充圖1i)。

 

3 AGPG促進細胞增殖和糖酵解

 

由于AGPG可能參與細胞增殖和乳酸生成,我們進一步研究了AGPG在細胞行為中的功能作用。KYSE150KYSE30細胞中的AGPG敲除顯著抑制細胞增殖和菌落形成(圖2a-d),AGPG敲除阻斷G1/S細胞周期轉換(圖2ef)。我們還檢測到了關鍵細胞周期蛋白,并觀察到AGPG基因敲除顯著增加了p27的表達,降低了CDK1的表達(圖2g),但沒有改變p21p53CDK3CDK6的表達。這些結果提示,AGPG可能通過調節p27等關鍵細胞周期蛋白和CDK1介導的G1/S進程來促進細胞增殖。為了驗證AGPG在代謝重編程中的作用,使用細胞外流量分析儀測量ESCC細胞的細胞外酸化率(ECAR)(圖2hi),證明AGPG基因敲除顯著損害糖酵解,這與我們之前的篩選結果一致。為了進一步確定葡萄糖的代謝流量,我們檢測了13C6葡萄糖孵育2 h后,ESCC細胞內13C標記的代謝中間產物的數量(圖2j)。基于液相色譜和質譜(MS)的代謝組分析表明,AGPG基因敲除后糖酵解的細胞內代謝物(3-磷酸甘油酸、丙酮酸和乳酸)明顯減少,進一步證實AGPG對葡萄糖轉化為乳酸至關重要(圖2k-m)。為了進一步確認AGPG的功能作用,我們使用CRISPR/Cas9基因組編輯系統生成了AGPG-CRISPR-KO細胞,結果顯示AGPG CRISPR KO顯著抑制ESCC細胞增殖和細胞周期進展。綜上所述,我們的數據表明,AGPG在調節腫瘤代謝重編程和腫瘤生長方面具有重要的功能。

4 AGPGPFKFB3直接相關

 

為了剖析AGPG介導的代謝重塑的分子機制,我們嘗試通過RNA pull-down分析和質譜分析來鑒定AGPG相關蛋白。通過比較AGPG結合蛋白和反義AGPG結合蛋白,發現非反義對照的sense-AGPGPFKFB3(圖3a)有特異性的相互作用,如前所述,PFKFB3也主要位于細胞核內。通過發現AGPG直接結合到純化His標記的重組PFKFB3(圖3b)進一步證實了這一觀察結果。AGPGPFKFB3之間的相互作用也通過RNA免疫沉淀(RIP)分析得到證實(圖3c)。為了進一步研究AGPGPFKFB3在體內的相互作用,我們進行了MTRAPwestern blotting,與陰性對照組相比,MS2-AGPGMCP-3FLAG質粒的共表達導致PFKFB3顯著富集,表明PFKFB3特異性地與AGPG結合(圖3d)。免疫熒光共聚焦分析表明,AGPGPFKFB3主要在細胞核內共聚焦,在細胞質內有部分共聚焦,提示AGPG-PFKFB3復合物可能在細胞核和細胞質中都起作用(圖3e)。此外,我們用qPCR檢測AGPG的表達,用western blotting檢測PFKFB3在一組ESCC細胞、12ESCC組織和匹配的正常食管組織(SYSUCC)中的表達。如所料,AGPG的表達與ESCCPFKFB3的表達呈正相關(圖3f),這進一步揭示了AGPGPFKFB3之間的功能關系。總之,這些結果表明AGPGPFKFB3是密切相關的,它們的相互作用在人類癌癥的發展中起著重要作用。

5 AGPG介導的T5片段與PFKFB3的相互作用

 

為了定位介導AGPGPFKFB3相互作用的區域,我們使用體外合成的全長(FLAGPGT11–800)、T2801–1140)、T31141–1700)、T41701–2030)和T52031–2321)片段進行RNA pull-down分析,然后通過western blotting分析產物。我們證明了T5片段可以與PFKFB3結合,而其他片段或珠狀對照不能結合。用純化的重組PFKFB3進一步驗證了這些結果(圖3g)。我們還進行了CLIP qPCR分析證明T5片段是負責結合PFKFB3的主要區域(圖3h)。刪除T5片段后,AGPG不能再與PFKFB3相互作用(圖3i)。AGPG FL的過表達足以防止AGPG敲除后觀察到的表型,包括糖酵解性重編程和細胞增殖(圖3jk)。這些結果顯示,AGPGPFKFB3相互作用和調節需要T5片段,而下游細胞過程可能是通過AGPGPFKFB3相互作用介導的。為了進一步確定與PFKFB3結合的特定基序,我們進行了HITS-CLIP,在這些基序中,CCAGCCA或類似的基序是高度排序的,可以通過多種方法識別。這些數據表明AGPGCCAGCCA基序對其結合PFKFB3和促進腫瘤糖酵解重編程的能力很重要。

 

6 AGPG阻斷APC/C介導的PFKFB3泛素化

 

由于PFKFB3含有一個激酶結構域和一個磷酸酶結構域,因此構建了三個含有FL1-520)、N-末端(N1-245)和C-末端(C 246-520)結構的帶有人類標記的PFKFB3載體,以鑒定與AGPG相關的PFKFB3殘基。有趣的是,我們證明AGPG主要與C-末端片段相互作用,與N-末端片段的結合zui小(圖4a)。然后,我們使用IgG對照進行RIP分析。如所料,AGPGPFKFB3C末端片段一起沉淀(圖4b)。然后,我們評估了AGPG-PFKFB3相互作用對PFKFB3的功能影響。有趣的是,shRNA介導的AGPG基因敲除顯著降低了PFKFB3的表達(圖4c),這也被CRISPR/Cas9證實在AGPG-CRISPR-KO細胞中(圖4d)。此外,過表達AGPG FL互補了AGPG缺失引起的PFKFB3shui平下降(圖4d)。這些數據表明AGPG可能通過T5片段調節PFKFB3蛋白shui平。并且蛋白酶體抑制劑MG-132恢復了PFKFB3shui平的降低(圖4e)。PFKFB3包含一個KEN盒,通過后期靶向蛋白質泛素化測試,PFKFB3被證明受到涉及一種細胞周期調節的E3泛素連接酶APC/C-Cdh1的降解。因此,為了進一步闡明AGPG阻斷PFKFB3泛素化的機制,我們使用PFKFB3Cdc27抗體進行coIP分析,以確定AGPG是否影響PFKFB3和活性APC/C之間的相互作用。結果顯示AGPG CRISPR KO顯著增加了PFKFB3/Cdc27的相互作用(圖4h),提示AGPG可阻斷Cdc27PFKFB3的結合。

7 AGPGp53的轉錄靶點

 

由于AGPG在腫瘤中高表達,我們試圖確定AGPG的調節機制。通路分析表明AGPG表達與p53呈負相關(圖5a)。對不同TP53基因型的細胞的分析表明TP53 KOHCT-116細胞的AGPGshui平高于對照細胞(圖5b),具有WT-TP53KYSE150)的細胞表達的AGPGshui平遠低于含有突變株(MTTP53TE-1KYSE3024的細胞(圖5c)。KYSE150HCT-116細胞中WT TP53的過度表達降低了AGPGshui平,而TP53的敲除增加了AGPG的表達,進一步證實了p53在調節AGPG表達中的作用(圖5d)。此外,通過qPCR分析,AGPG表達shui平與WT-TP53ESCC患者的TP53表達呈負相關(圖5eSYSUCCn = 72)。接下來,我們確定了p53介導的AGPG調控所需的區域,AGPG啟動子包含p53結合序列(圖5f),該序列被識別為p53結合區(p53-BR)(圖5g)。且含有完整p53-BRp53-BR-wt)的熒光素酶報告子的轉錄活性明顯弱于那些p53-BR缺失的報告子(p53-BR-mt)。此外,WT-TP53的共轉染選擇性地降低了具有完整p53-BR的報告者的轉錄活性(圖5h)。總之,我們的數據顯示p53AGPG轉錄中的重要調節作用,TP53的丟失或突變導致AGPG的顯著上調。包括缺氧、DNA損傷和癌基因表達等多個微環境因素下,我們研究了其參與的AGPG調控網絡(圖5i)。在293 T細胞中,癌基因KRasG12V的表達導致AGPG上調和TP53下調(圖5j),表明癌基因應激通過影響TP53狀態參與AGPG調控。我們還將我們的分析擴展到缺氧條件下,通過檢測暴露于嚴重缺氧或正常缺氧48小時的細胞中AGPGTP53的表達。WTMT p53均如先前報道的那樣上調;缺氧后,TP53細胞(KYSE150)中AGPG的表達降低,TP53細胞(TE-1KYSE30)中AGPG的表達顯著增加(圖5k)。這些結果表明,在WT-TP53存在下,缺氧誘導的AGPG上調可以被抑制。

8 AGPGESCC腫瘤生長的影響

 

然后,我們探討了AGPG在體內腫瘤發生中的作用。AGPG基因敲除顯著抑制了基于細胞的異種移植瘤生長(圖6a-c)。如血黃素和曙紅(HE)和免疫組化(IHC)結果所示,AGPG基因敲除降低了細胞增殖標記Ki67shui平,降低了PFKFB3CDK1shui平,但增加了p27shui平(圖6de);這些結果與我們的體外實驗結果一致,在患者來源的異種移植(PDX)模型(使用來自兩個ESCC患者的腫瘤組織生成,SYSUCC)(圖6f)中,通過體內優化的AGPG抑制劑消耗AGPG顯著降低腫瘤生長(圖6g-i),表明AGPG是一個有前途的治療靶點。PDX模型中使用的體內優化AGPG抑制劑的主要成分是反義寡核苷酸,它對核定位RNAs28具有較強的敲除作用。因此,如HEIHC分析所示,AGPG基因敲除顯著影響細胞增殖(Ki67所示),這可能歸因于前面提到的PFKFB3和下游CDK1p27表達的調節

9 p53-AGPG-PFKFB3軸參與ESCC的形成

 

為了確定p53-AGPG-PFKFB3是否與ESCC的發生有臨床關聯和病理關系,我們通過qPCRKi67檢測了AGPG的表達,通過IHC檢測了PFKFB3CDK1p27p53的表達。AGPG高組Ki67PFKFB3CDK1表達較高,p27p53表達較低,而AGPG低組則相反(圖7ab)。總之,我們推測p53-AGPG-PFKFB3的失調促進了ESCC的發展。與之前的報道一致,PFKFB3在惡性組織中高表達(圖7cd),并且PFKFB3高表達與ESCC患者的不良預后相關(圖7e)。接下來我們通過RNAScope-ISH檢測AGPG在這些組織中的表達。然后,將組織分為AGPG/PFKFB3高組、AGPG/PFKFB3中間組和AGPG/PFKFB3低組,其中AGPG/PFKFB3高組的預后比其他組差得多(圖7f)。這些數據進一步表明AGPG/PFKFB3是一個有前途的預后指標和潛在的治療靶點。

 

 

 

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