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不明覺厲!酰基-生物素交換法是個什么 鬼?

更新時間:2019-04-06瀏覽:3069次

大家在讀醫學研究文獻時常常會看到1種不明覺厲的研究技術,叫“Acyl-biotinyl Exchange”

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翻譯過來就是酰基-生物素交換法。這種方法主要用于研究蛋白質所發生的翻譯后修飾。

大多數蛋白分子都有多個不同的翻譯后修飾機制,用以調節蛋白功能。蛋白質zui常見的翻譯

后修飾方式叫磷酸化,主要發生在絲氨酸、蘇氨酸等殘基位點上,常常通過特異性的抗體進

行檢測。

除了磷酸化之外,蛋白質的翻譯后修飾的方式還有很多,例如糖基化、乙酰化、甲基化、亞

硝基化、谷胱甘肽化、棕櫚酰化等等。探索蛋白質翻譯后修飾的生物學意義是是生命科學的

研究熱點之1。

對于醫學研究而言,如果你在課題研究過程中發現某種新報道的蛋白質翻譯后修飾剛好參與

調控疾病過程中該蛋白的功能變化,那么恭喜你,1篇不錯的好文章已經在不遠處招手啦。

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酰基-生物素交換法是1種常見的檢測蛋白質翻譯后修飾的方法。蛋白質的半胱氨酸殘基上

的巰基基團,由于其高反應性,很容易發生各種氧化還原反應或酰化反應。酰基-生物素交

換法的實質是將所要檢測的翻譯后修飾轉化為酰基化的生物素基團。

整個交換過程要分三步完成:

第1步,先封閉可能干擾檢測的噪音,就是其他可被生物素酰基化的氨基酸殘基基團;

第二步,通過某種方式將所檢測的翻譯后修飾特異性的轉變成可進行酰基化反應的狀態,如

還原態的巰基狀態或游離的胺基狀態;

第三步,將生物素通過酰基化反應,結合那些轉變生成的可發生翻譯后修飾的氨基酸殘基。

這樣,原來的蛋白質翻譯后修飾會交換成酰基化的生物素。再通過可以選擇性結合生物素的

親和素制備層析柱,就可以富集這些生物素化的蛋白,再通過抗體11檢測。

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亞硝基化修飾是1種發生在半胱氨酸殘基巰基上的蛋白質翻譯后修飾,對很多心腦血管疾病

相關的蛋白功能有重要的調節效應。以亞硝基化為例,可以幫助我們了解如何通過酰基-生物素交換法來研究蛋白質的翻譯后修

飾。下面讓我們1起看看如何在實驗室里通過酰基-生物素交換法檢測某個蛋白亞硝基化水

平吧。

首先,工欲善其事必先利其器。不要嫌麻煩,認認真真的配制幾種溶液吧。

第1種,叫 HEN buffer11.9150gHepes 羥乙基哌qin乙磺酸. NaOH0.0584g 乙二胺四乙酸,

0.004166g 新亞銅樹堿,加入到 200 ml 超純水中),這可是整個酰基生物素交換反應發生的

基礎緩沖液哦。

第二種,叫 HENS buffer,就是在 HEN buffer 的基礎上,加入1定比例的 SDS(1般是把 HEN

buffer 25%SDS 9:1 配好)。

第三種,叫裂解液,是在第1種 HEN buffer 的基礎上,每毫升體積里加入 1% NP40 10 μl

protease inhibitor cocktail 10μl1 mM PMSF 10μl。裂解液是zui先用到的液體,用于破碎

細胞或組織。

第四種,叫洗脫液,在第二種 HENS buffer 的基礎上,加入 DTT 配制而成(1般 DTT 的終濃

度為 100-200mM)。

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然后,我們就可以按照上面介紹的三大步,對蛋白質上亞硝基化修飾的巰基來進行 Acyl

biotinyl Exchange Reaction 了。

第1步,封閉可能產生干擾的噪音:將細胞或組織樣本按 10μl/mg 500μl/孔(六孔板)

加入裂解液,在冰上進行超聲裂解處理 5 分鐘, 立即 412000g,離心 15 分鐘。取上清,

加入 4 倍體積的 blocking buffer

所謂的 blocking buffer,就是在每 ml HENS buffer 中加入 10ul MMTS 儲液(MMTS 的全稱是

methyl methanethiosulfonate,是1種特異性的巰基封閉劑,用二甲基甲酰胺配制到 2M 的儲

液濃度)。封閉反應在 50的恒溫水箱中進行,1般要 20 分鐘到半小時。

第二步,將亞硝基化修飾的巰基轉化為可進行酰基化反應的游離巰基:把裂解液轉入

離心管里。在離心管中1次性加滿-20 攝氏度的丙酮,-20下靜置 40 分鐘,立即 45000g

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離心 20 分鐘,去除上清。

重復步驟三次后得到比較純凈的蛋白質。去除丙酮上清后,向沉淀加入用 HENS buffer 所配

制的維生素 C (20 mM,1ml),溶解蛋白并將亞硝基化信號轉變為可酰基化的巰基分子。

第三步,將生物素通過酰基化反應結合這些轉變生成巰基。加入用 HENS buffer 所配制

的生物素 biotin–HPDP1mM, 1ml),室溫下孵育 2 小時(用搖床,1定注意避光)。反應完

成后再用丙酮沉淀的方法,去除反應液里小分子,制備純化蛋白。

把反應液轉移入離心管里。在離心管中1次性加滿-20 攝氏度的丙酮,-20靜置 40 分鐘,

立即 45000g 離心 20 分鐘,去除上清。重復步驟三次。用 2~3ml HENS buffer *溶

解沉淀物。

zui后,我們還有1個很關鍵的實驗步驟,就是從1堆蛋白質里把亞硝基化修飾的蛋

白分揀出來進行抗體檢測。不要忘了哦,此時,那些原本亞硝基化修飾的蛋白質早已被換

成了帶有酰基生物素標簽的蛋白,找出它們可1點也不難。

我們用1種填料親和素-agarose 制備成親和層析小柱,這可是個很高大上的玩意,可以把帶

有酰基生物素標簽的蛋白統統結合上去。

將溶解沉淀蛋白的 HENS 液灌注親和素-agarose 洗脫柱,循環多次,并用洗脫液沖洗灌注親和

-agarose 洗脫柱(確保洗脫液充滿整個柱體),在 100時處理 20 分鐘后,打開親和素-

agarose 洗脫柱下蓋,收集含目標蛋白洗脫液,并且用洗脫液繼續沖洗 2~3 次。收集蛋白。

酰基-生物素交換法的步驟雖然比較復雜,但是并不需要特殊的實驗設備,屬于成本不高但

逼格很高。基本上可以做 WESTERN BLOTTING 實驗的實驗室都可以做這方面的研究。

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而且,做疾病模型中的蛋白質翻譯后修飾的文章還不算很多,相當搶手,可以多多關注哦。

注意事項:

不是所有蛋白都會發生亞硝基化修飾。先做好文獻調研。維生素 C 還原處理的時間不宜太長。

Biotin–HPDP 配成儲液后分裝成小支。

丙酮沉淀蛋白后要盡量吹干或揮干里面的丙酮殘留。

親和素-agarose 洗脫柱填裝制備時要注意推平,不要產生縫隙或氣泡。

如果對該技術有興趣,推薦幾篇文獻看1看:

1.ffrey SR, Erdjument-Bromage H, Ferris CD, Tempst P, Snyder SH (2001) Protein S-nitrosylation: a

physiological signal for neuronal nitric oxide. Nat Cell Biol 3:193–197.

2.ffrey SR, Fang M, Snyder SH (2002) Nitrosopeptide mapping: a novel methodology reveals S

nitrosylation of dexras1 on a single cysteine residue. Chem Biol 9:1329 –1335.

3.stafa AK, Kumar M, Selvakumar B, Ho GP, Ehmsen JT, Barrow RK, Amzel LM, and Snyder SH (2007).

Nitric oxide S-nitrosylates serine racemase, mediating feedback inhibition of D-serine formation.

Proc Natl Acad Sci USA 104: 2950-2955.

 

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