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免疫組化之 8 大疑難解答及 10 大實戰經驗

更新時間:2019-03-24瀏覽:2591次

作者:子非魚

免疫組化(IHC),此種大氣上檔次的實驗自然深得科研者的寵愛。然而做過該實驗的人

都知道,IHC 看似容易,但其花樣百出的問題總是讓實驗汪們的精神備受摧殘,苦不堪言。

本文就對免疫組化進行抽絲剝繭的剖析,還其一片凈土。

675IHC 反應實驗流程

IHC 常見的 大疑問

Q1:冰凍切片和石蠟切片如何取材?

Answer: 冰凍切片取材可分為兩種情況:

676677

1)動物灌流固定:如小鼠心臟灌流,首先采用預冷的 1×PBS 灌流沖洗直至血液全部放出,

隨后灌注 4%PFA 直至小鼠僵直,而后解剖獲取組織,于 44%PFA 中固定 1h 左右,1×PBS

洗 次(30min/次),25%蔗糖溶液脫水 12h 左右包埋即可。

2)直接取材:直接選擇新鮮組織進行冰凍切片,此時不需要進行抗原修復。缺點:切出的

片子含水量會比較多,形成冰晶影響結果,而且后期的丙酮固定也會改變細胞的形態。

石蠟切片:動物組織取材(灌流與否都可以,并不影響后續的操作)后,置于 10%福爾馬林

溶液中固定 3-4 天后,脫水,包埋,即可進行石蠟切片操作。

Q2:石蠟切片和冰凍切片的區別比較

Answer: 1)石蠟切片制備過程較復雜,抗原活性差,但切片薄(3-5μm),便于觀察細胞的細

微結構,且常溫保存即可,非常方便。2)冰凍切片較厚(8-12μm),操作簡單,抗原活性好,

但是保存時間短,且一定放在-80的低溫冰箱中。

Q3:一抗的選擇要點是什么?

Answer1)一般單克隆抗體特異性強,但親和力相對小,檢測抗原靈敏度相對低;而多克

隆抗體特異性弱,但抗體的親和力強,靈敏度高,但易出現非特異性染色(可通過封閉來避

免)。2)抗體的比例可依據抗體說明書或 western blot 的抗體比例來做即可。3)對于組織樣 

本,一般要在 37孵育 1-2h 或 4冰箱孵育過夜(效果zui佳,且拿出后需 37復溫 45min),

并保持濕盒里的濕度來防止抗體蒸發。對于難以著色的,在第二天還需將濕盒置于室溫孵育。Q4:如何選擇封閉血清?

Answer:封閉血清一般是和二抗同一來源,可封閉非特異性結合位點,降低背景噪音。也可

使用小牛血清、BSA、羊血清等,但不能與一抗的來源一致。

Q5DAB 顯色時間如何把握?

Answer:可選擇一張陽性的片子,用計時器精確計時在顯微鏡下判斷出具體時間后,再對所

有片子進行顯色,采用相同的時間來界定。一般如果抗體濃度適宜,操作無誤,10 分鐘內肯

定能夠顯色,如果超過該時間,說明一抗比例不夠或者封閉太久等等原因。顯色時間越短,

則說明抗體濃度高或抗體孵育時間過長,需下調抗體濃度或縮短抗體孵育時間。

Q6IHC 復染時間的選擇?

Answer:蘇木素復染時間一般為 5min 左右,可調整,染色時間太淺,可延長時間,反之縮

短時間;隨后進行鹽酸酒精分化,數秒即可,自來水洗,zui后置于氨水中返藍。

Q7:免疫組化的結果如何分析?

Answer1)必設對照組。如陰性、陽性及自身對照。

678由表中可知,只有 6實驗結果有意義。1-5 均因對照組的結果已否定抗體的特異性或因

ICH 技術操作存在錯誤等而使實驗結果失去意義,則必須重復實驗或換用抗體。

2)陽性著色細胞計數法。在 40 倍光鏡下,隨機選擇不重疊的 10 個視野,人工或機器計

數陽性著色細胞,每組 3-6 張不同動物組織切片,然后進行組間比較即可。

3)灰密度分析法。通過在不同組別和不同動物組織切片上選擇相同區域、相同條件下用

image j 進行灰密度分析,然后進行統計分析即可。

4)分級法。免疫組化的半定量一般分為三級:弱(+),中(++),強(+++)。以綠色免疫熒

光為例,則表現為淺綠色熒光、明顯綠色熒光和亮綠色耀眼熒光。弱(+=1,中(++=2

強(+++=3。至少隨機觀察 5-10 個 HPF。然后根據(+% x 1 +++% x 2 ++++% x 3

計算出數值;總數值<1.0 者為(+),1.0-1.5 者為(++), >1.5 者為(+++)

679Q8IHC 常見的疑難雜癥有哪些?

Answer

680免疫組化(IHC)的實戰經驗

1.把要做的切片先分好,做幾個抗體可分幾盒,不正常組織與正常組織要分開。其余做預實

驗用。

2.選擇實驗要做的抗體時,要結合他們的正常組織和癌組織的分別表達率。

6813.試劑盒的選擇可結合生物素強弱的情況。如:肝組織生物素含量高,S-P 試劑盒生物素含

量也高,故不能配合使用。

4.每次開始做時,都必須先清點實驗的必需品是否齊全。想好可能發生的意外,并先想好補

救措施。當抗體不夠用的情況下,原先買的抗體zui好不要用完,留做可能需要的驗證試驗。

新的抗體要盡量同公司,同批號。

5.烤片(單一或綜合)程度要適情況而定,可中途拿出甩一甩,盡可能先放在烤箱里烤 

時以上。切勿把片烤得太久了。程度剛好,脫蠟效果才會好。注意做好不同條件的切片標記。 

注意溫度穩定,再烤片。

6.二甲苯脫蠟。溫度過低時,可先把二甲苯整罐放進烤箱加熱,或者可把片放在二甲苯里一

起加熱脫蠟,這樣效果會更好;若溫度適宜,那還是在室溫下脫蠟,要不可能會適得其反。

時間也是適情況而定。

7.高壓修復時,要注意稀釋比例,修復液的種類(EDTA 不可以重新進行利用,可能發生交叉

作用),PH 值等。高壓鍋內壓力未降至正常時不可打開,壓力正常后可多放會兒,能更好的

利用余壓,把握程度。若是多次修復,每次都需先把鍋內熱水倒掉,換冷水,保證條件的可

重復性。

8.抗體反復凍融可使效價降低。抗體要防止污染。不可用塑料保存,塑料可吸附抗體。抗體

稀釋:應遵循現用現配的原則,對于 PBS(其他稀釋液,注意 PH 值,PBS 為偏中堿性)稀

釋的抗體zui好要當天使用。稀釋比例恰好為佳,注意前帶和后帶效應。

6829.吹干封片時不能有泡泡。若是沒封好,可進行二甲苯、酒精脫樹膠,吹干再次封片,但鏡 

下效果會明顯變差。因而,若沒必要,zui好不要再次脫膠。DAB 顯色需用中性樹膠封片,AEC

(易溶于有機溶劑)需用水性膠封片。

10.剛封完的載玻片會移動,故切片還沒干時,盡量不要碰到蓋玻片,可避免樹膠溢出,片的

整體效果不好。

附錄:臨床上常用免疫組化指標

通常惡性腫瘤,免疫組化耐藥預后標記(共 個 marker)為:P-gpGSTπTOPOIIKi-67

而乳腺癌免疫組化耐藥預后標記(共 個 marker)為:P-gpGSTπTOPOKi-67ER

PRC-erbB-2

6836846856866875.2 ELISA

一句話知曉實驗方法怎么選?WBSPR

688ELISA

作者:麥子

在分子生物學實驗室里的玩法,無非就是用某種特定的刺激物(如細胞活素)去刺激一些細

胞或組織,讓它們 high 起來,然后分析細胞對這些外源刺激物的反應,檢測細胞內哪條信

號通路被激活或失活,或者什么蛋白被分泌出來。這里面就有很多種方法,哪種zui合適,關

鍵看你要檢測這個反應的哪個方面的特性。

WB

建立蛋白質的個人檔案

一個典型的免疫印跡實驗(Western BlotWB)可檢測信號通路中某種蛋白質的特性、表達

和分布,分析容量大、敏感度高、特異性強。

但 至 于 蛋 白 蛋 白 相 互 作 用 則 要 用 另 一 種 更 復 雜 的 方 法 , 即 免 疫 共 沉 淀 法 ( Co

immunoprecipitationCo-IP),它接近細胞內的生理情況,是以成為經典方法。

689WB 影視,實驗做累了可以用

SPR

想知道 Ta 和 Ta 能有多親密?

表面等離子共振(Surface Plasmon ResonanceSPR)除了研究蛋白-蛋白相互作用(例如受體

-配體相互作用),還有可研究小分子-蛋白或細胞-蛋白的相互作用。這種方法不需要標記蛋

白(熒光標記或同位素標記),還可以實時定量分析這些相互作用的親和力、熱力學、動力

學特性。SPR 是分析動力學和親和力的金標準。

690SPR 咖啡,熬夜讀文獻的時候用

EMSA

蛋白瞄著核酸,我們又瞄著那些蛋白

電泳遷移率實驗(Electrophoretic Mobility Shift AssayEMSAzui初用于檢測 DNA 結合蛋白與

相應的 DNA 序列結合的情況,可做定性和定量分析,包括細胞核中的轉錄因子(如 NF-kB 

的活性等等,現在也常用于研究 RNA 結合蛋白和相應的 RNA 序列相互作用。

691這些分析用酶聯免疫吸附實驗(EenzymeLinked ImmunosorbentAssayELISA)也可以做,原 

理差不多。

EMSA,德國家居品牌,休息區的椅子可以嗎?

PCR

把小樹養大才能更好地招風

轉錄因子激活并和靶基因結合之后,該基因就被激活。PCRPolymerase Chain Reaction)或

692Real Time PCR 可以把特定的 DNA 序列大幅擴增,便于檢測活性基因的表達情況。

PCR,用途很廣啊

ELISA

追蹤到天涯海角!

如果要看看細胞外如何,比如細胞培養上清液或體液中的某種蛋白質分泌情況,則通常選用

ELISA,從而獲知相應基因的活性。 

 

 

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