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干貨 | 免疫組化染出來都是全國江山一片 紅,咋整?

更新時間:2019-03-24瀏覽:1029次

作者:毛博

665全國江山一片紅,這可不是閱兵日的朋友圈,而是在做免疫組化啊!好好的一張片子染得臟

臟的。一下子整個人都不好了。這里,毛博根據自己做免疫組織化學近 10 年的經驗和體會

(被師弟師妹稱為免疫組化王子,哈),總結出了導致非特異性染色的八個大坑,以及避免

掉坑里的一些做法。皆是獨門絕技,不要眨眼咯!

1. 抗體問題,真的是一分錢一分貨啊!

一抗用多克隆抗體容易出現非特異性染色,建議用高純度,高效價的針對更具特異性抗原決

定簇的單克隆抗體來解決。單克隆抗體很貴,不過結果真的很好。尤其是背景非特異性染色

不會太深。真是一分價錢一分貨。一抗過期也會造成杯具,所以要注意抗體的有效期。

2. 抗體濃度過高/孵育時間過長

一抗濃度太高也是出現非特異性染色的常見原因。解決的辦法就是預實驗。每次使用新抗體

前應該多做預實驗,摸索出的工作濃度,不能簡單地按照說明書來用。另一個常見原

因就是孵育時間過長。解決的辦法就是定時器。加上抗體后,立刻調好定時器,提醒自己及

時終止反應,就會避免這個問題。

3. DAB 染色時間太長/變質

DAB 的孵育時間過長,會造成背景非特異性染色。DAB 的顯色時間不是一成不變的,主要靠

自己在顯微鏡下盯著,一旦出現淺淺的棕色的時候,就要馬上沖洗。出現棕色的時間過短,

666表明抗體濃度過高;出現棕色的時間過長,表明抗體濃度過低。DAB 要保存于避光干燥的地

方,現用現配,臨用前才加入 H2O2。圖 1 就沖洗的有些晚了;圖 2 就是剛剛好,染色效果

棒棒噠!

4. 內源性酶和生物素

內源性酶和生物素也會造成非特異性染色,特別是一些內源性酶生物素含量豐富的組織,如

肝臟,腎臟,脾臟等。處理的辦法為:滅活堿性磷酸酶:zui常用的方法是將左旋咪唑(24 mg/mL

加入底物液中,并保持 PH 值在 7.6-8.2,即能除去大部分內源性堿性磷酸酶;對于酸性磷酸

酶,可以用 50 mmol/L 的酒石酸抑制;對于內源性過氧化物酶,可以用 0.9%的雙氧水來滅

活。對于內源性生物素,染色前將切片浸于 25 μg/mL 親和素溶液中 15 分鐘,PBS 清洗 15

鐘后即可染色。也可以 24 mg/mL 的卵白素封片 15 分鐘。

6675. 組織變干

一下子染太多片子的時候,容易出現這種情況。解決的辦法就是不要貪多嚼不爛。一次少染

幾張。還有就是試劑充分覆蓋組織,超出組織邊緣 2 mm。然后用 PAP 筆在組織周圍畫一個

圈圈,把修復液圈在里面。避免修復液流走。圈圈應該距離組織邊緣 3-4 mm

6. 浸泡時間過長

切片在緩沖液或修復液里面浸泡過夜,也會引起杯具。這都是偷懶的做法。但是有時候也是

可以偷一下懶的。毛博的獨門秘技就是 4°C 冰箱。只要把容器放在 4°C 冰箱里,過夜*沒

668有問題。

7. 清洗不充分

清洗一定要充分。PBS 液一定要雙蒸水新配,用之前再次測 PH 值。緩沖液用 0.05 mol/L

Tris-HCL0.15 mol/L NaCl 即可。如果加一點去垢劑 Tween-20 就更好了。

8. 封閉血清問題

是否選擇了正確的封閉血清。原則是選擇二抗動物的非免疫血清,例如二抗是羊抗兔,就要

選擇非免疫羊血清。用 PBS 稀釋為 3-10%的溶液孵育切片,37°C 10-30 分鐘。這里不用洗,

直接甩掉即可。毛博再貢獻一個獨門絕招,直接用奶粉也可以。用 5%的脫脂奶粉就可以了。

而且效果還不錯。怎么樣?簡單吧。

免疫組織化學是個苦活臟活。步驟多,時間長,還要接觸有毒有害的物質。要是好好的一張

片子染出來都是全國江山一片紅,那才叫虧大發了。以上,毛博介紹了自己的一些心得體會,

希望對大家有所幫助。

 

 

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