熟妇高潮喷沈阳45熟妇高潮喷_人妻丰满熟妇av无码区乱_黑人人妻AV一区二区三_少妇太爽丰满一区二区

當前位置:首頁 > 技術文章 > 發高分 SCI, 不會免疫組化(IHC)怎么 行?

發高分 SCI, 不會免疫組化(IHC)怎么 行?

更新時間:2019-03-24瀏覽:1270次

作者:花花是個學術張

花花相信大家對 IHC 一定不陌生,世界那么大,實驗方法層出不窮,但是免疫組化卻是經典

中的經典,想看看別的高大上的技術?不急,我們先來復習復習免疫組化。

免疫組化,免疫組織化學技術(immunohistochemistry),是一項利用抗原抗體反應,通 

過使標記抗體的顯色劑顯色來確定組織細胞內抗原,對蛋白定位,定性的實驗技術。

免疫組化主要用的是組織標本細胞標本兩大類,組織標本包括石蠟切片(病理切片和

組織芯片)和冰凍切片。石蠟切片,對組織形態保存好,保存時間也長,雖然對組織抗原暴

露有影響,但可以抗原修復,所以石蠟切片仍然是首xuan的標本制作方法

好了,重點來了,下面是花花多年來總結的免疫組化步驟和經驗,各位看官不要錯過哦!

① 在 60°烤箱烤片 30~60min,這一步是為了使蠟片水分蒸發和石蠟融化,好讓組織切片牢

659660

固貼在玻片上。做切片是免疫組化的前提切片子zui好是找專業培訓過的人員切片,片子的厚

薄均勻,切片的完整,無褶無刀痕。考研刀工的時候。

② 脫蠟水化,依次放入二甲苯各 10min,乙醇梯度(高至低)各 2min,水。

后用自來水洗一下,但不要直接對著切片沖洗

③ 抗原修復,小編用的是高壓熱修復,ph6.0 的檸檬酸鹽緩沖液,一定要全部浸泡切片,

等高壓鍋冒氣后 5min 結束,自然冷卻,溫度驟降可能引起脫片哦。3%H2O2 避光浸泡 15min

當然有的朋友用 EDTA 修復或者說使用微波修復等方法也是可以的,但是每一種抗體對不 

同的抗原修復方法的反應是不一樣的,得具體對待。

④ 這一步有神器,用組傳的免疫組化油筆圍繞組織畫圈,接下來就能看見它的功效了。

PBS 洗 5min x 3 次。PBS 會被鎖在畫的圈中,不會流干,保證不干片。

⑤ 滴加 5%BSA BSA 用 PBS 溶)稀釋的一抗,每個組織約 20ul用 200ul 的槍頭抹

過夜或者 37°1~2h,小編用的是第二種方法。(每種組織大小不一樣,面積大概 乘 1

的可以 20ul 就夠了,對于類似 NPC 的組織就沒必要這么大了,關于一抗的問題,個人建議

過夜的方法,當然 37°1~2hour 也是可以的,兩種方法沒法說誰好誰不好,不同的抗體對

方法的敏感性是不一樣的再次 PBS 洗 5min x 3 次。

⑥ 滴加二抗,一滴每個,用 200ul 的槍頭抹平,室溫靜置 30min本人用的是××公司

(此處堅決不植入廣告)貨號 GK500705 的二抗檢測試劑盒,很好用,極力推薦。

⑦ 再次 PBS 洗 5min x 3 ⑧ DAB- H2O2 顯色 10min。(BC=1:5025ul 每個,現配現用),在這時要觀察,如果染色

明顯,不到 10 分鐘即可蒸餾水洗終止顯色,但是一般超過 20min 都不會有什么好結果。

⑨ Mayer 蘇木素染色 30s,水洗,鹽酸酒精分化 3s,流水浸 15min

⑩ 脫水,乙酸 2min,乙醇梯度(低至高)各 2min,二甲苯 5min

中性樹膠封片。

結果分析:

鏡下細胞核呈藍色,陽性結果呈深淺不一的棕色

比如這樣:

661 結果分析主要有兩種方法,陽性著色細胞計數法和評分法。前者是在 40*光鏡下,隨機

10 個視野下計數陽性著色細胞;后者則是在光學顯微鏡下按染色程度(分陰性著色,

淡黃色,分淺褐色,分深褐色)和陽性范圍(分 0-25%分 26-50%分 51-75%4

分 76-100%)評分,zui終分數相加。

再來看下反面教材

zui常見的非特異性著色:

662還有背景過深的:

要避免成為上述的兩種典型,做出一張可以見老板的結果,每步都要且做且思考。花花再啰

663664

嗦幾句:

脫蠟和脫水的步驟呢,每個實驗室都有自己獨到的方法,用的乙醇的梯度不*相同,大

家按照自己的習慣那套來就好。但要注意,脫蠟和水化不全引起局灶性反應,會導致非特異

性著色

一定要防止干片!干片也很容易引起非特異性著色。

在用槍頭抹平抗體時,要盡量將槍頭放平,用斜面而不要用尖頭接觸組織,這一步要輕柔

小心,可能你只是輕輕刮到幾下,但鏡下組織就變得亂七八糟的了(別問我是怎么知道的)

4 PBS 在洗的時候,不要對著組織沖洗,會脫片。小編的方法是將沖洗著力點放在玻片的邊

緣,讓液體自然流向組織。

一抗濃度至關重要,這直接影響了zui終的結果,摸條件時設置一抗濃度梯度。建議同時

置一個陽性對照,可以排除一抗之外的操作問題。

背景染色過深的話,就要考慮一抗濃度過高或者一抗時間過長,顯色時間過長這些問題了。 

降低組織非特異性染色,可以縮短一抗,二抗的時間,稀釋抗體,也可以增加幾次 PBS 

洗。或者直接用單抗。 免疫組化往往作為檢測某蛋白在組織的表達情況出現在預實驗中,免疫組化的結果可能

將直接影響課題的后續設計和進展。如果說我們的科研課題是一個大世界的話,免疫組化是

我們看向這個世界的敲門磚。

做好免疫組化

我們一起去更大的世界看看

 

Contact Us
  • 聯系QQ:277124344
  • 聯系郵箱:277124344@qq.com
  • 聯系電話:19540095576
  • 聯系地址:廣州市白云區鶴正街1號中海聯8立方創意園A1棟304室

掃一掃  微信咨詢

© 2024 廣州市超博科技有限公司 版權所有  備案號:

技術支持:        GoogleSitemap

服務熱線
13760660301

微信服務號