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重組質粒的連接、轉化及篩選

更新時間:2019-03-20瀏覽:3768次

重(zhong)組質(zhi)粒(li)的連接、轉(zhuan)化(hua)及篩選

概述

質粒具有穩定可靠和操作簡便(bian)的優點。如果要克隆較小的 DNA的片段(<10kb)且結構簡(jian)

單(dan),質粒要比(bi)其它(ta)任何載體都要好。在(zai)質粒載體上(shang)進行克隆(long),從(cong)原理(li)上(shang)說是很簡單(dan)的,先用限

制(zhi)性內切酶切割質(zhi)粒DNA和目的DNA片段, 然后體(ti)外使兩者相連接, 再用所得到(dao)重組質(zhi)粒

轉化(hua)細(xi)菌,即可完成。但在實際工作(zuo)中, 如(ru)何區分插入有外源 DNA 的重組質粒和無插入而自

身環化的(de)載體分子是較為困難的(de)。通過調整連接反(fan)應中外源 DNA的(de)片段(duan)和(he)載(zai)體 DNA 的(de)濃度

比例,可以將(jiang)載(zai)體(ti)的自身環化限制在一定程度之下,也可以進一步采取一些特(te)殊的克隆策(ce)略,

如載體去磷酸化(hua)等來zui大(da)限度的降(jiang)低(di)載體的自身環(huan)化(hua),還可(ke)以利用遺傳學手段如 α 互補現象(xiang)

等來鑒別重組(zu)子和非重組(zu)子。

外(wai)源(yuan) DNA的片段和質粒載體的連接反應策略(lve)有以下幾(ji)種:

1、帶有(you)(you)非互補突出端(duan)的片段(duan) 用兩(liang)種(zhong)不(bu)同(tong)的限制(zhi)性(xing)內切酶進(jin)行(xing)消化可以產(chan)生帶有(you)(you)非互

補的(de)粘性末端,這(zhe)也(ye)是zui容易克隆的(de) DNA的(de)片段,一般情況下,常用質(zhi)粒(li)載體均帶(dai)有多個不同

限制酶(mei)的(de)識別(bie)序列(lie)組(zu)成的(de)多(duo)克(ke)隆位(wei)點(dian),因(yin)而幾乎總能找到(dao)與外源 DNA的(de)片段末端匹配的(de)限制

酶切位(wei)點的載體(ti),從而將外源片(pian)段定向地克(ke)隆到載體(ti)上。也(ye)可在 PCR 擴增時,在 DNA的片(pian)

段兩端人為加上不同酶(mei)切位點以便與(yu)載體相(xiang)連。

2、帶(dai)有相(xiang)同(tong)的(de)粘性末端 用相(xiang)同(tong)的(de)酶或同(tong)尾酶處理可得(de)到這樣的(de)末端。 由于(yu)質粒載體

也必須用(yong)同(tong)一種酶消化,亦得到同(tong)樣的兩個相同(tong)粘(zhan)性末端,因此在連接反應中外源片段(duan)和質

粒載體 DNA 均可能發生自身(shen)環化或(huo)幾個分子串連(lian)形成寡聚物, 而且正反兩(liang)種連(lian)接方(fang)向都(dou)可

能有。所以,必須仔細調整連(lian)接(jie)反應中(zhong)兩種 DNA 的(de)濃度(du), 以便使正確的(de)連(lian)接(jie)產物的(de)數量(liang)達(da)

到zui高shui平。還可(ke)(ke)將載(zai)(zai)體(ti) DNA 的 5'磷(lin)(lin)酸(suan)(suan)基團用(yong)堿性磷(lin)(lin)酸(suan)(suan)酯(zhi)酶(mei)去(qu)掉, zui大限(xian)度(du)地(di)抑制質粒DNA 的自身環(huan)化。帶 5'端磷(lin)(lin)酸(suan)(suan)的外源 DNA的片段可(ke)(ke)以(yi)有效(xiao)地(di)與去(qu)磷(lin)(lin)酸(suan)(suan)化的載(zai)(zai)體(ti)相連, 產生

一個帶有(you)兩個缺口(kou)的(de)開(kai)環分子,在(zai)轉(zhuan)入 E. coli 受體菌(jun)后的(de)擴(kuo)增過程中(zhong)缺口(kou)可自動修復。

3、帶(dai)有(you)平(ping)末端 是(shi)由(you)產(chan)生(sheng)平(ping)末端的限制酶或核酸外切酶消化產(chan)生(sheng),或由(you) DNA 聚合(he)酶補

平所致。由于平端的連(lian)接效率(lv)比(bi)粘(zhan)性末(mo)端要低得多,故在其連(lian)接反應(ying)中,T4 DNA 連(lian)接酶(mei)的

濃(nong)度和外源DNA及載(zai)體DNA濃(nong)度均要高得(de)多。通常(chang)還需加入低濃(nong)度的聚乙二醇(PEG 8000)

以促進 DNA 分子(zi)凝(ning)聚(ju)成(cheng)聚(ju)集(ji)體的(de)物(wu)質以提高轉化效率。

特殊情況下,外源 DNA 分子(zi)的末(mo)端與所用的載(zai)體末(mo)端無(wu)法相互匹配,則(ze)可以在線狀質粒載(zai)體

末(mo)端(duan)或外源 DNA的片段末(mo)端(duan)接上合適(shi)的接頭(tou)(linker)或銜接頭(tou)(adapter)使其匹配, 也可以有

控制的(de)使(shi)用 E. coli DNA 聚合酶Ⅰ的(de) klenow 大片(pian)段部分填平 3'凹端,使(shi)不相匹配的(de)末端轉(zhuan)

變為互補末(mo)端或轉為平末(mo)端后(hou)再進(jin)行(xing)連(lian)接。

本實驗所使用的載體質(zhi)粒 DNA 為 pBS,轉化受體菌為 E. coli DH5α 菌株。由(you)于 pBS 上

帶有 Ampr 和 lacZ 基因,故(gu)重組(zu)子的(de)篩(shai)(shai)選(xuan)采用(yong) Amp 抗(kang)性篩(shai)(shai)選(xuan)與 α-互(hu)補現(xian)象篩(shai)(shai)選(xuan)相(xiang)結合的(de)

方(fang)法。

因 pBS 帶(dai)有(you)(you) Ampr 基因而外源(yuan)片段上不帶(dai)該基因,故轉化受體菌后只有(you)(you)帶(dai)有(you)(you) pBS DNA

的(de)轉化(hua)子才(cai)能(neng)在含有(you) Amp 的(de) LB 平板上(shang)存活下(xia)來;而只帶(dai)有(you)自身環化(hua)的(de)外源片段的(de)轉化(hua)子則

不能存活。此為初步的抗性篩(shai)選。

pBS 上帶有 β-半乳糖苷(gan)(gan)酶(mei)基(ji)因(lacZ)的調控序列和 β-半乳糖苷(gan)(gan)酶(mei) N 端 146 個氨基(ji)酸的

編碼序列。這個(ge)編碼區中插入了(le)一(yi)個(ge)多(duo)克隆(long)位點,但并沒有破壞 lacZ 的閱(yue)讀框(kuang)架,不影響其(qi)正

常功能(neng)。E. coli DH5α 菌株帶有(you) β-半(ban)乳糖苷酶 C 端部(bu)分序列(lie)的編(bian)碼(ma)信息。在(zai)各(ge)自(zi)獨立的情

況下,pBS 和 DH5α 編碼的 β-半(ban)乳(ru)糖苷酶的片段(duan)都沒有酶活性(xing)。但在 pBS 和 DH5α 融(rong)為一

體時可形成具有(you)酶(mei)活性的蛋白質。這種 lacZ 基(ji)因上缺失近操縱基(ji)因區(qu)段的突變體與帶有(you)完

整(zheng)的近操縱基因區段的 β-半(ban)乳糖(tang)苷酸陰性突變體(ti)之間實(shi)現互(hu)補的現象叫(jiao) α-互(hu)補。由(you) α-互(hu)補產生(sheng)的 Lac+ 細菌較(jiao)易識別,它在生(sheng)色(se)底物 X-gal(5-溴-4 氯-3-吲哚(duo)-β-D-半(ban)乳糖(tang)苷)下存在

下被 IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導形成(cheng)藍(lan)色菌落。當外源片段插入(ru)到 pBS 質粒的

多(duo)克隆位點上后會導(dao)致讀碼框架改變, 表達蛋白失活, 產生的(de)氨基(ji)酸片(pian)段(duan)失去 α-互(hu)補能力,

因此在同樣(yang)條件下(xia)含(han)重(zhong)組(zu)質粒的(de)轉(zhuan)化子在生色誘導培養基上只能形成白色菌落。在麥康凱培

養基(ji)上,α-互補產(chan)生的(de) Lac+細菌由于含 β-半乳糖苷酶,能分(fen)解麥康凱培養基(ji)中的(de)乳糖,產(chan)

生乳(ru)酸,使(shi) pH 下降(jiang),因而產生紅色菌落,而當外源片(pian)段插入后,失(shi)去 α-互補能力(li),因而

不產生 β-半乳糖苷酶,無法分解培養基中的(de)乳糖,菌落(luo)呈(cheng)白色(se)。由此可(ke)將重(zhong)組(zu)質粒與自身(shen)

環化(hua)的載體 DNA 分開。此為 α-互補現象篩選(xuan)。

材(cai)料(liao)、設備及試劑(ji)

一、 材(cai)料

外源(yuan) DNA的(de)片段(duan): 自行制備的(de)帶限(xian)制性末端(duan)的(de) DNA 溶(rong)液,濃(nong)度已知; 載體 DNA: pBS 質

粒(Ampr ,lacZ),自行提取(qu)純(chun)化,濃(nong)度已知; 宿(su)主菌: E. coli DH5α,或 JM 系(xi)列等具有 α-互補能

力(li)的菌株。

二(er)、 設備(bei)

恒(heng)溫搖床(chuang),臺式(shi)高速離(li)心機,恒(heng)溫shui浴鍋, 瓊(qiong)脂糖凝膠電泳裝置(zhi), 電熱(re)恒(heng)溫培養箱,

電泳儀無菌,工作臺, 微(wei)量移液(ye)槍(qiang),eppendorf 管。

三、 試(shi)劑

1、連接反應緩沖液(ye)(10×):0.5mol/L Tris·Cl (pH7.6),100mol/L MgCl2,100mol/L

二硫(liu)蘇(su)糖醇(DTT)(過濾(lv)滅菌),500μg/ml 牛血清清蛋白(組分 V.Sigma 產品(pin))(可用可不(bu)

用),10mol/L ATP(過濾滅(mie)菌)。

2、T4 DNA 連接(jie)酶(T4 DNA ligase);購買成品(pin)。 3、X-gal 儲液(20mg/ml): 用(yong)二甲基甲酰(xian)胺溶解 X-gal 配制成 20mg/ml 的儲液, 包以

鋁箔(bo)或黑紙(zhi)以防(fang)止(zhi)受光照(zhao)被破壞, 儲存(cun)于-20℃。

4、IPTG 儲液(ye)(200mg/ml): 在(zai) 800μl 蒸餾(liu)shui中溶解 200mg IPTG 后(hou),用蒸餾(liu)shui定(ding)容至

1ml,用 0.22μm 濾膜過濾除菌,分裝(zhuang)于(yu) eppendorf 管(guan)并儲(chu)于(yu)-20℃。

5、麥康凱選擇(ze)性(xing)培養基(Maconkey Agar):取 52g 麥康凱瓊(qiong)脂加蒸餾shui 1000ml,微

火煮沸至*浴解,高(gao)壓滅(mie)菌,待冷至 60℃左(zuo)右加入 Amp 儲(chu)存液使終濃度為(wei) 50mg/ml,

然后搖(yao)勻后涂板。

6、含 X-gal 和 IPTG 的(de)篩選培(pei)養(yang)基(ji):在事(shi)先制備好的(de)含 50μg/ml Amp 的(de) LB 平板表

面加(jia) 40ml X-gal 儲液(ye)和 4μlIPTG 儲液(ye),用無菌玻棒將溶液(ye)涂勻,置(zhi)于 37℃下放置(zhi) 3-4 小(xiao)時(shi),

使培養基(ji)表面的液(ye)體*被吸收。

7、感受態細胞制備(bei)試劑

8、煮沸法快速分離(li)質粒試(shi)劑

9、質粒酶及(ji)電(dian)泳試(shi)劑

操作步(bu)驟

一、 連接反(fan)應

1、取新的經滅菌(jun)處(chu)理的 0.5ml eppendorf 管, 編號。

2、將(jiang) 0.1μg 載體 DNA 轉移到無菌離心管中,加等摩爾量(liang)(可稍多(duo))的(de)外(wai)源(yuan) DNA的(de)片段。

3、加蒸餾shui至(zhi)體積(ji)為(wei) 8μl,于 45℃保溫 5 分鐘,以使重新(xin)退火的粘端解鏈(lian)。將(jiang)混和物冷(leng)

卻(que)至 0℃。

4、加入(ru) 10×T4 DNA ligase buffer 1μl, T4 DNA ligase 0.5μl, 混勻后用微(wei)(wei)量離心機

將液體全(quan)部甩到管(guan)底,于 16℃保(bao)溫 8-24 小時(shi)。 同時(shi)做二組(zu)對(dui)照(zhao)反應,其(qi)中(zhong)對(dui)照(zhao)組(zu)一(yi)只(zhi)有質粒載體無外源 DNA;對(dui)照(zhao)組(zu)二只(zhi)有外源

DNA的片段(duan)沒(mei)有質粒載體。

二、 E. coli DH5α 感(gan)受態細胞的制備及轉化(hua)

每組連接(jie)反應混(hun)和物各取(qu) 2μl 轉化 E. coli DH5α 感(gan)受態細胞。具體方法見(jian)第三(san)章。

三、 重組質粒的(de)篩選(xuan)

1、每(mei)組連接反應轉(zhuan)化原液(ye)取(qu) 100μl 用無菌玻(bo)棒均勻涂布于篩選培(pei)養基上,37℃下培(pei)養

半小時(shi)以上(shang),直至液體被(bei)*吸收。

2、倒置(zhi)平板于 37℃繼續培養 12-16 小時,待(dai)出(chu)(chu)現(xian)明顯(xian)而(er)又未相互重疊的單菌落時拿出(chu)(chu)

平板。

3、放于(yu) 4℃數小(xiao)時,使顯色(se)*(此步(bu)麥康凱培養基不做)。

不(bu)帶(dai)有 pBS 質粒 DNA 的(de)細胞,由(you)于(yu)無 Amp 抗(kang)性,不(bu)能在含有 Amp 的(de)篩(shai)選(xuan)培養基(ji)上成

活。帶有 pBS 載體的(de)轉(zhuan)化子(zi)由于具有 β-半乳糖苷(gan)酶活性(xing),在麥康凱篩選培養基(ji)上(shang)呈現為紅(hong)色(se)

菌(jun)落。在 X-gal 和 ITPG 培養基上(shang)為藍色菌(jun)落。帶有重組質粒轉化子由于喪失了 β-半乳(ru)糖(tang)苷

酶活(huo)性,在麥康(kang)凱(kai)選(xuan)擇(ze)性培(pei)養基(ji)和 x-gal 和 ITPG 培(pei)養基(ji)上均為白色菌落。

四、 酶切(qie)鑒(jian)定重組質(zhi)粒

用無(wu)菌牙簽挑取白色單菌落接(jie)種(zhong)于含(han) Amp 50μg/ml 的 5ml LB 液(ye)體培養基中,37℃下

振蕩培養 12 小(xiao)時(shi)。使(shi)用煮(zhu)沸(fei)(fei)法快速分離(li)質粒 DNA 直接電泳,同時(shi)以煮(zhu)沸(fei)(fei)法抽提的 pBS 質

粒做對照,有(you)插入片(pian)段的重組質粒電(dian)泳時遷移率(lv)較 pBS 慢。再用與連(lian)接未(wei)端相對應的限制

性內(nei)切(qie)酶(mei)(mei)進一步進行酶(mei)(mei)切(qie)檢驗。還可用雜交法篩選重組質粒(li)。

[注意]

1、DNA 連接(jie)(jie)酶用量(liang)與 DNA的片段的性質有關,連接(jie)(jie)平齊(qi)末端,必須加(jia)大酶量(liang),一(yi)般使

用連(lian)接粘性(xing)末端(duan)酶量的(de) 10-100 倍。 2、在(zai)連(lian)接帶有(you)粘性(xing)末端(duan)的(de) DNA的(de)片段時,DNA 濃度一般為 2-10mg/ml,在(zai)連(lian)接平齊

末端時,需加(jia)入 DNA 濃度至 100-200mg/ml。

3、連接反應(ying)(ying)后,反應(ying)(ying)液在(zai)(zai) 0℃儲存數天,-80℃儲存 2 個月,但是在(zai)(zai)-20℃冰凍保存將

會降低轉化效率。

4、粘性末端形(xing)成的氫鍵在低(di)溫下更(geng)加穩定,所(suo)以(yi)盡管 T4 DNA 連接酶的zui適(shi)反應溫度

為(wei) 37℃,在連接粘(zhan)性(xing)末(mo)(mo)端(duan)時,反(fan)應溫度以(yi) 10-16℃為(wei)好,平(ping)齊末(mo)(mo)端(duan)則(ze)以(yi) 15-20℃為(wei)好。

5、在連(lian)接反應中,如不對(dui)載體分(fen)子進行去 5'磷(lin)酸基(ji)處理,便用過量的(de)外源 DNA的(de)片(pian)段(duan)

(2-5 倍),這(zhe)將(jiang)有助于減少載體的(de)自身(shen)環化,增加外源 DNA 和(he)載體連(lian)接的(de)機會(hui)。

6、麥康凱選擇(ze)性瓊(qiong)脂組成的平板,在含(han)有適當抗(kang)生素時,攜(xie)有載體 DNA 的轉化子(zi)為

淡紅色菌落(luo),而(er)攜有帶(dai)插入片段的重組質粒轉化子為白色菌落(luo)。該(gai)產品篩(shai)選效果同藍白斑篩(shai)

選,且(qie)價(jia)格低(di)廉。但需及時挑(tiao)取白色菌落,當培養時間延長,白色菌落會逐(zhu)漸變成微紅色,

影(ying)響挑選。

7、X-gal 是 5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳(ru)糖(tang)

(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)以半乳糖苷酶(b-galactosidase)shui解

后生成的吲哚(duo)衍生物顯藍色。IPTG 是異丙基硫代半乳(ru)糖苷(Isopropylthiogalactoside),

為非生理(li)性(xing)的(de)誘(you)導物,它可以誘(you)導 lacZ 的(de)表達。

8、在含有(you) X-gal 和 IPTG 的篩選培養基上,攜帶(dai)載體 DNA 的轉化子為藍色菌(jun)落,而

攜帶插入片段的重組質粒轉(zhuan)化子為白色菌落,平板如在 37℃培養后放于冰箱 3-4 小時可(ke)使

顯色反應充分,藍色菌落明(ming)顯。

 

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