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重組質粒的連接、轉化及篩選

更新時間:2019-03-20瀏覽:3627次

重組質粒的連接、轉化及篩選

概述

質粒具有穩定可靠和操作簡便的優點。如果要克隆較小的 DNA的片段(<10kb)且結構簡

單,質粒要比其它任何載體都要好。在質粒載體上進行克隆,從原理上說是很簡單的,先用限

制性內切酶切割質粒DNA和目的DNA片段, 然后體外使兩者相連接, 再用所得到重組質粒

轉化細菌,即可完成。但在實際工作中, 如何區分插入有外源 DNA 的重組質粒和無插入而自

身環化的載體分子是較為困難的。通過調整連接反應中外源 DNA的片段和載體 DNA 的濃度

比例,可以將載體的自身環化限制在一定程度之下,也可以進一步采取一些特殊的克隆策略,

如載體去磷酸化等來zui大限度的降低載體的自身環化,還可以利用遺傳學手段如 α 互補現象

等來鑒別重組子和非重組子。

外源 DNA的片段和質粒載體的連接反應策略有以下幾種:

1、帶有非互補突出端的片段 用兩種不同的限制性內切酶進行消化可以產生帶有非互

補的粘性末端,這也是zui容易克隆的 DNA的片段,一般情況下,常用質粒載體均帶有多個不同

限制酶的識別序列組成的多克隆位點,因而幾乎總能找到與外源 DNA的片段末端匹配的限制

酶切位點的載體,從而將外源片段定向地克隆到載體上。也可在 PCR 擴增時,在 DNA的片

段兩端人為加上不同酶切位點以便與載體相連。

2、帶有相同的粘性末端 用相同的酶或同尾酶處理可得到這樣的末端。 由于質粒載體

也必須用同一種酶消化,亦得到同樣的兩個相同粘性末端,因此在連接反應中外源片段和質

粒載體 DNA 均可能發生自身環化或幾個分子串連形成寡聚物, 而且正反兩種連接方向都可

能有。所以,必須仔細調整連接反應中兩種 DNA 的濃度, 以便使正確的連接產物的數量達

到zui高shui平。還可將載體 DNA 的 5'磷酸基團用堿性磷酸酯酶去掉, zui大限度地抑制質粒DNA 的自身環化。帶 5'端磷酸的外源 DNA的片段可以有效地與去磷酸化的載體相連, 產生

一個帶有兩個缺口的開環分子,在轉入 E. coli 受體菌后的擴增過程中缺口可自動修復。

3、帶有平末端 是由產生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產生,或由 DNA 聚合酶補

平所致。由于平端的連接效率比粘性末端要低得多,故在其連接反應中,T4 DNA 連接酶的

濃度和外源DNA及載體DNA濃度均要高得多。通常還需加入低濃度的聚乙二醇(PEG 8000)

以促進 DNA 分子凝聚成聚集體的物質以提高轉化效率。

特殊情況下,外源 DNA 分子的末端與所用的載體末端無法相互匹配,則可以在線狀質粒載體

末端或外源 DNA的片段末端接上合適的接頭(linker)或銜接頭(adapter)使其匹配, 也可以有

控制的使用 E. coli DNA 聚合酶Ⅰ的 klenow 大片段部分填平 3'凹端,使不相匹配的末端轉

變為互補末端或轉為平末端后再進行連接。

本實驗所使用的載體質粒 DNA 為 pBS,轉化受體菌為 E. coli DH5α 菌株。由于 pBS 上

帶有 Ampr 和 lacZ 基因,故重組子的篩選采用 Amp 抗性篩選與 α-互補現象篩選相結合的

方法。

因 pBS 帶有 Ampr 基因而外源片段上不帶該基因,故轉化受體菌后只有帶有 pBS DNA

的轉化子才能在含有 Amp 的 LB 平板上存活下來;而只帶有自身環化的外源片段的轉化子則

不能存活。此為初步的抗性篩選。

pBS 上帶有 β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調控序列和 β-半乳糖苷酶 N 端 146 個氨基酸的

編碼序列。這個編碼區中插入了一個多克隆位點,但并沒有破壞 lacZ 的閱讀框架,不影響其正

常功能。E. coli DH5α 菌株帶有 β-半乳糖苷酶 C 端部分序列的編碼信息。在各自獨立的情

況下,pBS 和 DH5α 編碼的 β-半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。但在 pBS 和 DH5α 融為一

體時可形成具有酶活性的蛋白質。這種 lacZ 基因上缺失近操縱基因區段的突變體與帶有完

整的近操縱基因區段的 β-半乳糖苷酸陰性突變體之間實現互補的現象叫 α-互補。由 α-互補產生的 Lac+ 細菌較易識別,它在生色底物 X-gal(5-溴-4 氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在

下被 IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導形成藍色菌落。當外源片段插入到 pBS 質粒的

多克隆位點上后會導致讀碼框架改變, 表達蛋白失活, 產生的氨基酸片段失去 α-互補能力,

因此在同樣條件下含重組質粒的轉化子在生色誘導培養基上只能形成白色菌落。在麥康凱培

養基上,α-互補產生的 Lac+細菌由于含 β-半乳糖苷酶,能分解麥康凱培養基中的乳糖,產

生乳酸,使 pH 下降,因而產生紅色菌落,而當外源片段插入后,失去 α-互補能力,因而

不產生 β-半乳糖苷酶,無法分解培養基中的乳糖,菌落呈白色。由此可將重組質粒與自身

環化的載體 DNA 分開。此為 α-互補現象篩選。

材料、設備及試劑

一、 材料

外源 DNA的片段: 自行制備的帶限制性末端的 DNA 溶液,濃度已知; 載體 DNA: pBS 質

粒(Ampr ,lacZ),自行提取純化,濃度已知; 宿主菌: E. coli DH5α,或 JM 系列等具有 α-互補能

力的菌株。

二、 設備

恒溫搖床,臺式高速離心機,恒溫shui浴鍋, 瓊脂糖凝膠電泳裝置, 電熱恒溫培養箱,

電泳儀無菌,工作臺, 微量移液槍,eppendorf 管。

三、 試劑

1、連接反應緩沖液(10×):0.5mol/L Tris·Cl (pH7.6),100mol/L MgCl2,100mol/L

二硫蘇糖醇(DTT)(過濾滅菌),500μg/ml 牛血清清蛋白(組分 V.Sigma 產品)(可用可不

用),10mol/L ATP(過濾滅菌)。

2、T4 DNA 連接酶(T4 DNA ligase);購買成品。 3、X-gal 儲液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解 X-gal 配制成 20mg/ml 的儲液, 包以

鋁箔或黑紙以防止受光照被破壞, 儲存于-20℃。

4、IPTG 儲液(200mg/ml): 在 800μl 蒸餾shui中溶解 200mg IPTG 后,用蒸餾shui定容至

1ml,用 0.22μm 濾膜過濾除菌,分裝于 eppendorf 管并儲于-20℃。

5、麥康凱選擇性培養基(Maconkey Agar):取 52g 麥康凱瓊脂加蒸餾shui 1000ml,微

火煮沸至*浴解,高壓滅菌,待冷至 60℃左右加入 Amp 儲存液使終濃度為 50mg/ml,

然后搖勻后涂板。

6、含 X-gal 和 IPTG 的篩選培養基:在事先制備好的含 50μg/ml Amp 的 LB 平板表

面加 40ml X-gal 儲液和 4μlIPTG 儲液,用無菌玻棒將溶液涂勻,置于 37℃下放置 3-4 小時,

使培養基表面的液體*被吸收。

7、感受態細胞制備試劑

8、煮沸法快速分離質粒試劑

9、質粒酶及電泳試劑

操作步驟

一、 連接反應

1、取新的經滅菌處理的 0.5ml eppendorf 管, 編號。

2、將 0.1μg 載體 DNA 轉移到無菌離心管中,加等摩爾量(可稍多)的外源 DNA的片段。

3、加蒸餾shui至體積為 8μl,于 45℃保溫 5 分鐘,以使重新退火的粘端解鏈。將混和物冷

卻至 0℃。

4、加入 10×T4 DNA ligase buffer 1μl, T4 DNA ligase 0.5μl, 混勻后用微量離心機

將液體全部甩到管底,于 16℃保溫 8-24 小時。 同時做二組對照反應,其中對照組一只有質粒載體無外源 DNA;對照組二只有外源

DNA的片段沒有質粒載體。

二、 E. coli DH5α 感受態細胞的制備及轉化

每組連接反應混和物各取 2μl 轉化 E. coli DH5α 感受態細胞。具體方法見第三章。

三、 重組質粒的篩選

1、每組連接反應轉化原液取 100μl 用無菌玻棒均勻涂布于篩選培養基上,37℃下培養

半小時以上,直至液體被*吸收。

2、倒置平板于 37℃繼續培養 12-16 小時,待出現明顯而又未相互重疊的單菌落時拿出

平板。

3、放于 4℃數小時,使顯色*(此步麥康凱培養基不做)。

不帶有 pBS 質粒 DNA 的細胞,由于無 Amp 抗性,不能在含有 Amp 的篩選培養基上成

活。帶有 pBS 載體的轉化子由于具有 β-半乳糖苷酶活性,在麥康凱篩選培養基上呈現為紅色

菌落。在 X-gal 和 ITPG 培養基上為藍色菌落。帶有重組質粒轉化子由于喪失了 β-半乳糖苷

酶活性,在麥康凱選擇性培養基和 x-gal 和 ITPG 培養基上均為白色菌落。

四、 酶切鑒定重組質粒

用無菌牙簽挑取白色單菌落接種于含 Amp 50μg/ml 的 5ml LB 液體培養基中,37℃下

振蕩培養 12 小時。使用煮沸法快速分離質粒 DNA 直接電泳,同時以煮沸法抽提的 pBS 質

粒做對照,有插入片段的重組質粒電泳時遷移率較 pBS 慢。再用與連接未端相對應的限制

性內切酶進一步進行酶切檢驗。還可用雜交法篩選重組質粒。

[注意]

1、DNA 連接酶用量與 DNA的片段的性質有關,連接平齊末端,必須加大酶量,一般使

用連接粘性末端酶量的 10-100 倍。 2、在連接帶有粘性末端的 DNA的片段時,DNA 濃度一般為 2-10mg/ml,在連接平齊

末端時,需加入 DNA 濃度至 100-200mg/ml。

3、連接反應后,反應液在 0℃儲存數天,-80℃儲存 2 個月,但是在-20℃冰凍保存將

會降低轉化效率。

4、粘性末端形成的氫鍵在低溫下更加穩定,所以盡管 T4 DNA 連接酶的zui適反應溫度

為 37℃,在連接粘性末端時,反應溫度以 10-16℃為好,平齊末端則以 15-20℃為好。

5、在連接反應中,如不對載體分子進行去 5'磷酸基處理,便用過量的外源 DNA的片段

(2-5 倍),這將有助于減少載體的自身環化,增加外源 DNA 和載體連接的機會。

6、麥康凱選擇性瓊脂組成的平板,在含有適當抗生素時,攜有載體 DNA 的轉化子為

淡紅色菌落,而攜有帶插入片段的重組質粒轉化子為白色菌落。該產品篩選效果同藍白斑篩

選,且價格低廉。但需及時挑取白色菌落,當培養時間延長,白色菌落會逐漸變成微紅色,

影響挑選。

7、X-gal 是 5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖

(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)以半乳糖苷酶(b-galactosidase)shui解

后生成的吲哚衍生物顯藍色。IPTG 是異丙基硫代半乳糖苷(Isopropylthiogalactoside),

為非生理性的誘導物,它可以誘導 lacZ 的表達。

8、在含有 X-gal 和 IPTG 的篩選培養基上,攜帶載體 DNA 的轉化子為藍色菌落,而

攜帶插入片段的重組質粒轉化子為白色菌落,平板如在 37℃培養后放于冰箱 3-4 小時可使

顯色反應充分,藍色菌落明顯。

 

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