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質粒 DNA 的提取

更新時間:2019-03-20瀏覽:3575次

質粒 DNA 的提(ti)取(qu)

一(yi)、原理

采用堿變性發抽提取質(zhi)粒 DNA。該法是(shi)基于染色體 DNA 與質(zhi)粒 DNA 的變性預(yu)復性的

差異而達(da)到(dao)分離目的(de)(de)的(de)(de)。在 PH 大于 12 的(de)(de)堿性條件下,染色(se)體 DNA 的(de)(de)氫鍵斷裂,雙螺旋

結構解(jie)開(kai)變性(xing)。質粒 DNA 的大部分(fen)氫鍵(jian)也斷裂,但超螺旋共價閉合環狀結構的兩條(tiao)互補(bu)鏈

不(bu)會*分離(li),當以 pH5.2 的乙(yi)酸鈉高(gao)鹽緩沖液調(diao)節其 pH 至中(zhong)性(xing)時(shi),變性(xing)的質粒 DNA 又

恢復(fu)到(dao)原來的構型,保存在溶液中。而(er)染(ran)色體(ti) DNA 不能復(fu)性(xing)而(er)形成(cheng)纏連的網狀結構。通過

離心(xin),染色體(ti) DNA 與不(bu)穩定的大分子 RNA,蛋白(bai)質(zhi)-SDS 復合物等(deng)一起(qi)沉淀下來(lai)而被(bei)除

去。

二、方(fang)法

1. 挑取一環在(zai) LB 固體培養基平(ping)板上生長的含 PUC57 質粒的大腸(chang)桿菌,接在(zai)含有 100μ

g/ml 氨芐青霉素(Amp)的 LB 液(ye)體培養基(5ml/15ml 試管)中,37℃震(zhen)搖培養過

夜。

2. 將(jiang) 1.5ml 菌液(ye)加入微離心管(guan)中,14000r/min,離心 10 秒,其取上清液(ye)。反復數次,收

集全部菌體。

3. 傾去上清(qing),濾(lv)紙吸(xi)干(gan)。

4. 加 30μlTE 緩沖(chong)液(10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0),振蕩起菌體。

5. 加 30μlTENS 溶液(10mmol/L Tris—HCl, pH8.0,1mmol/L EDTA,0.1mol/L

NaOH,0.5%SDS),震蕩 10 秒至溶液變粘稠(chou)。

6. 加 150μl 3.0mol/LnaAC,震(zhen)蕩 3—5S,14000r/min,離心(xin) 3 分鐘,沉(chen)淀細胞碎片及染

色體 DNA。

7. 上清液轉移至另一微離心(xin)管中,甲等體(ti)積胞和酚,混勻,12000r/min,離心(xin) 2 分(fen)鐘。

8. 上層水(shui)相轉移至另(ling)一位離(li)心管(guan),加 2 倍量冷(leng)水(shui)乙醇(chun),14000r/min,離(li)心 20 分鐘(zhong)。

9.傾去乙醇(chun)(chun),加入 7o%冷乙醇(chun)(chun)淋洗。

10.傾去乙醇,濾紙吸于,真空抽吸 2~3 分鐘。

lI.加人 50μlTE 緩沖液,溶(rong)解(jie) DNA。

12,加(jia)入 1μl 核(he)(he)糖核(he)(he)酸酶(10mg/m1),14000r/min,離心 2s,使核(he)(he)糖核(he)(he)酸酶與管(guan)底(di)液體混

勻。

13.37℃水浴 30min。

14.樣品放一(yi) 20℃冰箱(xiang)保存(cun)備用。

三、試劑

1.TE 緩沖液(ye)(10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0)

配制(zhi)方法:

Tris 1.211g

EDTA.Na 0.037g

用 800ml 重蒸水溶(rong)解,用分析純鹽酸調整 pH 至 8.0,加(jia)重蒸水定容至 1000ml。

2.TENS 溶液:(10mmol/L Tris—HCl, pH8.0,1mmol/L EDTA,0.1mol/L

NaOH,0.5%SDS) 配(pei)制(zhi)方(fang)法:

NaOH O.4 g

SDS 0.5 g

加 80mlTE 緩沖液溶(rong)解(jie)。加 TE 緩沖液定容(rong)至 lOOml.

3.3.0mol/1 醋酸鈉溶液(pH5.2)

配制方法:醋酸鈉(na) 24.6g

用 70ml 重(zhong)蒸水溶解,再用冰乙酸(suan)大(da)約調 pH 至(zhi) 5.2,加重(zhong)蒸水定容至(zhi) 100ml。

純凈的酚使(shi)用時(shi)不(bu)需要(yao)重蒸(zheng)。市售的酚一般為(wei)紅色或黃色結晶體,使(shi)用之前必(bi)須重蒸(zheng),除去

能引起 DNA 和 RNA 斷裂和聚合的雜質。將苯酚(fen)置于(yu) 65℃水浴中溶解,重(zhong)新進行蒸餾(liu),當(dang)

溫度升至(zhi) 183℃時(shi),開始(shi)收集在若干個棕色瓶中。純酚和重(zhong)蒸(zheng)酚都應貯存在-20℃使用前取(qu)

一瓶重蒸(zheng)酚于分液漏斗中,加(jia)入等體積的(de) lmol/L Tris-HCI(pH8.0)緩沖液,立即加(jia)蓋(gai),激(ji)

烈(lie)振(zhen)蕩,并加入固(gu)體(ti) Tris 搖(yao)勻(yun)調 pH(一般(ban) 100ml 苯酚約加 l 克固(gu)體(ti) Tris)分層后測上(shang)層水相

pH 至(zhi) 7.6 一 8.0。從分(fen)液漏斗中放出下層酚相于棕色(se)瓶中,并加(jia)一定體積 0.1mol/L Tris

HCI(pH8.o)覆蓋在酚相(xiang)上,置 4℃冰箱貯存備用。酚是一種強腐蝕劑,能(neng)引起(qi)腐蝕性(xing)損

傷,操(cao)作時應(ying)戴上眼鏡和(he)手套。如果皮膚上濺上了酚,應(ying)用大(da)量水沖洗(xi)或用肥皂水沖洗(xi)。酚

在空(kong)氣極易氧化變紅,要隨時加(jia)蓋(gai),也可(ke)加(jia)入抗(kang)氧化劑 o.1%8 一羥基喹啉及 o.2%β—

巰基乙醇。

5.無(wu)水(shui)乙(yi)醇(chun)

置(zhi)-20℃冰箱中保存備(bei)用

6.70%乙醇

置(zhi)-20℃冰(bing)箱(xiang)中保存(cun)備用

7.核糖核酸(suan)酶(10mg/ml)

配(pei)制方法(fa):稱取 l0mg 核(he)糖核(he)酸酶(mei) A(RNaseA,美國 SIGMA 或中科(ke)院上海(hai)生物化學研

究所東風試劑廠)。于(yu)滅菌(jun)的(de)微(wei)離心管內,加 1 ml 100mmol/pH5.0 的(de) NaAC 溶(rong)液(*溶(rong)

解),即為 10mg/ml RNase,為了破(po)壞脫氧核糖核酸(suan)酶(DNase,置 80℃水(shui)浴中 10min 或

100℃水浴 2 min,然后置(zhi)一 20℃(或家(jia)用冰箱的冰格內)保存(cun)。

四(si)、材料

1.菌種:

大(da)腸(chang)桿菌(jun)(pUC57)

2.培養基

LB 液體培養基

精解蛋白胨(dong) 3g

酵母浸(jin)出粉 1.5g

氯化鈉 3 g

葡(pu)萄糖 0.6g 按上(shang)述配(pei)方用(yong)重蒸水(ddH2O 或 dH2O 表(biao)示,下同)溶解(jie)至 300ml。用(yong) 10mol/LnaOH

調

pH 至(zhi) 7.2~7.4。分裝于 15ml 試管中,每支 5ml。然后置高(gao)壓蒸汽消毒鍋以 1.1kg/

cm2 滅菌(jun) 20min.

l 抗菌素:

氨芐青霉(mei)素(Amp)臨用(yong)時(shi)用(yong)無菌水配制(zhi)在(zai)無菌有蓋(gai)試管中,濃度為 100mg/m1。

五(wu)、儀器:

恒(heng)溫振蕩(dang)器。

低溫冰箱-20℃

真(zhen)空泵。

臺式(shi)高速(su)離(li)心機(ji)

六、說明

1.質粒 DNA 提取(qu)的方法(fa)(fa)很多,有(you)堿變性(xing)法(fa)(fa)、羥基磷(lin)灰石(shi)柱(zhu)層析法(fa)(fa)、溴化(hua)乙(yi)錠一氯化(hua)銫(se)

梯度(du)超離心法(fa)(fa)(fa)等。本(ben)次(ci)實驗是(shi)一種小(xiao)量(liang)快速提取(qu)法(fa)(fa)(fa)。小(xiao)量(liang)快速提取(qu)法(fa)(fa)(fa)也有多種,但(dan)基本(ben)原理

和步(bu)驟(zou)是一(yi)致的.包括下述(shu)步(bu)驟(zou):(1)裂解菌體細(xi)胞;(2)質粒(li)和染色體 DNA 的分(fen)離(li);(3)除

去(qu)蛋白(bai)質。RNA 及其他影響(xiang)限制性酶活性的(de)細(xi)胞成分;(4)除去(qu)提璣(ji)過(guo)程中(zhong)使用(yong)的(de)去(qu)垢劑、

等(deng)。

2.在(zai)基因(yin)操作實驗中(zhong).保(bao)存或(huo)提取 DNA 過程中(zhong),一般都采用 TE 緩沖液,而不選用其它(ta)

的緩沖液。雖然很多緩沖系統.如磷酸鹽緩沖系統,硼酸系統都(dou)符(fu)合細胞內環(huan)境(jing)的生理范

圍,可(ke)以作為 DNA 的保存液,但在某些實驗中,這些緩沖對(dui)會(hui)影響實驗。如(ru)在轉化(hua)實驗

中,要用到 Ca+,如果川磷(lin)酸鹽緩沖液,磷(lin)酸根將與 Ca2+產(chan)生(sheng) Ca(PO4+沉淀(dian);在各種工具

酶反應時(shi),不同的(de)酶對輔助因子(zi)的(de)種類及數(shu)量要(yao)求(qiu)不同,有的(de)要(yao)求(qiu)高(gao)鹽離子(zi)濃度,有的(de)則要(yao)

求低鹽濃度,采用(yong) Tris—HCI 緩沖系統,不存在金(jin)屬(shu)離子的干擾(rao)作(zuo)用(yong);作(zuo)中(zhong)的 EDTA 是二價(jia)

離子(zi)

Mg2+、Ca2+等的(de)螯(ao)合劑,可降(jiang)低(di)系(xi)統中的(de)這(zhe)些(xie)離(li)(li)子濃度,而(er)這(zhe)些(xie)離(li)(li)產是脫氧核糖核酸酶的(de)

輔(fu)

助因子(zi),所以 EDTA 可(ke)以抑制脫(tuo)氧(yang)核糖核酸酶對 DNA 的(de)降(jiang)解作(zuo)用(yong)。

3、TENS 中 NaOH:核酸在 pH 大于 5,小(xiao)于 9 的(de)溶液中穩定,怛當 pH 大于 12 或(huo)小(xiao)于 3

時,就會引起(qi) DNA 兩(liang)條鏈之間(jian)氫鍵的解離而(er)變(bian)性(xing)。TENS 中(zhong)有 NaOH 使其 pH 大(da)于 12,

因而

使染(ran)色體 DNA 與質(zhi)粒 DNA 變性(xing)。

TENS 中的 SDS:SDS 是離子型表面(mian)活性(xing)劑。它(ta)主要功能有:(1)溶解細胞膜上的脂肪與

蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)質(zhi)(zhi),因而溶解膜(mo)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)而破壞細(xi)胞(bao)膜(mo);(2)解聚細(xi)胞(bao)中的核蛋(dan)(dan)(dan)白(bai);(3)SDS 能(neng)與蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)結(jie)合

成為 R1 一(yi) O 一(yi) SO3…R2+一蛋(dan)白(bai)質的復合物,使蛋(dan)白(bai)質變性(xing)而沉淀下來。但是 SDS 能抑制

核(he)

糖核酸(suan)酶(mei)的(de)作用,所以(yi)在以(yi)后的(de)提取(qu)過程中,必須把它去干凈,防止在下一步操(cao)作中(用Rnase 去除(chu) RNA 時(shi))受干擾。

4、3.0mol/L NaAC(pH5.2)使(shi) pH 大于 12 的 DNA 抽提液回(hui)到(dao)中性(xing),使(shi)變性(xing)的質粒(li)

DNA

能夠復性,并能穩定(ding)存(cun)在(zai)。染(ran)色體 DNA 不(bu)能復性(染(ran)色體 DNA 不(bu)存(cun)在(zai)超螺旋(xuan)共價閉合環結(jie)

構(gou)) 而高鹽的 3mol/L NaAC 有利于變(bian)性(xing)的大分子染色體 DNA、RNA、以及 SDS—蛋(dan)白(bai)質

復合(he)(he)物凝聚沉淀。pH5.2 也(ye)能中和核酸上的電(dian)荷(he),減少相(xiang)互斥力而互相(xiang)聚合(he)(he)。同時,鈉鹽

能與

SDS 一蛋白質(zhi)復合物作用(yong)后,形成溶(rong)解度較小的鈉鹽形式復合物,使(shi)沉淀(dian)更*。

5.飽和酚:酚是一種表面變(bian)性劑,屬非極性分(fen)子。水是極性分(fen)子。當蛋白質溶液(ye)與(yu)酚混(hun)

合(he)合(he)時(shi),蛋白質分子(zi)之間的水分子(zi)被酚擠走,使(shi)蛋白質失去水合(he)狀態而(er)變性。經(jing)過離心。變

性蛋白質的(de)(de)密度比水(shui)(shui)的(de)(de)密度大,因而(er)與(yu)水(shui)(shui)相(xiang)分離,沉(chen)淀在水(shui)(shui)相(xiang)下(xia)面,酚比重更(geng)大,保留(liu)在zui、

下層。酚作為(wei)變性劑.也(ye)有(you)一些缺點:(1)酚與(yu)水(shui)有(you)一定程度的(de)互溶,酚相中水(shui)的(de)溶解(jie)可達大

約 10%~15%,溶解在這(zhe)部分水相中有(you) DNA 會損(sun)失,(2)酚很(hen)容易氧化,變成(cheng)粉紅色,氧

化(hua)的(de)酚容(rong)易降解 DNA,解決酚氧化(hua)和帶水的(de)辦法是將酚重(zhong)蒸(zheng),除去氧化(hua)的(de)部分,再用 Tris

—HCl 緩(huan)沖液飽和,使酚(fen)(fen)不(bu)至(zhi)于奪去 DNA 中的水,帶走部分 DNA。飽和酚(fen)(fen)中加上 8 一羥(qian)

基(ji)硅啉及巰(qiu)基(ji)乙醇,防(fang)止酚氧化,還是弱的螫合劑.可抑制 DNase。由于(yu)有顏(yan)色.溶解(jie)在

酚中后,使酚帶上(shang)

顏色,便于(yu)酚(fen)相與(yu)水相的分肉,酚(fen)飽(bao)和后,表面蓋(gai)上一層 Tris 水溶液,隔絕空(kong)氣,阻止(zhi)酚(fen)氧

化。

6.關(guan)于無水乙醇沉淀 DNA 的說明:

用無水乙(yi)醇(chun)沉淀(dian) DNA,是實驗中zui、常用的沉淀(dian) DNA 的方法(fa)。乙(yi)醇(chun)的優點是具有極性,

可以(yi)以(yi)任意(yi)比(bi)例(li)和水相混溶,乙醇與核酸不會起化學反(fan)應,對 DNA 很安全,因(yin)此是(shi)理想的

淀(dian)劑(ji)。

乙醇之所以(yi)(yi)能沉淀 DNA,是由(you)于 DNA 溶液是以(yi)(yi)水(shui)合狀(zhuang)態穩定存在的(de) DNA,當加入(ru)乙

醇.乙醇會(hui)奪(duo)去(qu) DNA 周(zhou)圍的水分(fen)子(zi),使 DNA 失水而易(yi)于聚合沉淀,一般實驗(yan)中,用(yong) 2 倍

體積(ji)

的(de)無水乙(yi)醇與 DNA 相混合。使(shi)乙(yi)醇的(de)zui、終含量占 67%左右。由此(ci)可預見,也(ye)可用(yong) 95%乙(yi)

醇(chun)

沉淀 DNA,但是用 95%乙(yi)醇使(shi)總(zong)體積增大.而 DNA 在醇溶液中總(zong)有一(yi)定程度的溶解。因

而(er)

DNA 損失也增大,影(ying)響收率(lv)。

乙(yi)醇沉淀 DNA 溶(rong)液時,DNA 溶(rong)液中(zhong)應該有一定的鹽(yan)濃度,中(zhong)和 DNA 表(biao)面電荷。如果溶(rong)

液中鹽(yan)濃度太低,要加(jia) NaAC 或 NaCl 至zui、終濃度 O.1 一 O.25mol/l 在 pH 8 左右的 DNA

溶液中,DNA 分子帶負電(dian)荷(he),加一(yi)定濃度(du)的 NaAC 或 NaCl 使 Na+中和 DNA 分子上的(de)負(fu)

電(dian)荷,減(jian)少 DNA 分(fen)子之間(jian)的同(tong)性電(dian)荷相(xiang)斥力,易于互(hu)相(xiang)聚合而(er)形成 DNA 鈉鹽沉(chen)淀。當加

入(ru)的鹽溶液濃(nong)度太(tai)低時(shi)。只有部分 DNA 形成 DNA 鈉鹽而聚合,這樣就造成 DNA 沉淀不(bu)*。但當加入(ru)的鹽溶液濃(nong)度太(tai)高(gao)時(shi),其效果也不(bu)好,在沉淀的 DNA 中,由于過(guo)多的鹽雜(za)

質存(cun)在,影響 DNA 的(de)酶切(qie)等反應(ying),必須(xu)進(jin)行(xing)洗滌或(huo)重沉淀。

乙醇沉(chen)淀 DNA.一般(ban)采用低溫條(tiao)件(jian),這是由于(yu)在低溫條(tiao)件(jian)下.分子運(yun)動大大減少,DNA

易(yi)于(yu)聚合而沉淀。為了使質(zhi)粒 DNA 能(neng)充分沉淀,一般保(bao)存時間總是(shi)過長的,同時也(ye)要視樣

品的(de)體積而異,在微(wei)量離心管中(zhong)的(de)樣(yang)品要比 40 毫升離心管中(zhong) DNA 樣(yang)品的(de)量少,冷卻就較(jiao)

迅速。大量提取 DNA 時,目前習慣上(shang)常采用如下幾種方法:

保(bao)存(cun)在家用冰箱(xiang)結(jie)冰盒內 過夜(ye)

保存(cun)在-2℃亡冰箱內(nei) 過夜(ye)

保(bao)存在-70℃冰箱內 30mm~2h

放置干冰中(zhong)(約(yue)-20℃) 30min

放置干(gan)冰加酒精中(約-70℃) 16mm

放(fang)置在液(ye)氮(dan)缸中液(ye)氮(dan)的氣相內,不(bu)可(ke)以浸在液(ye)氮(dan)中(溫(wen)度在-198℃左右)5~15min。

除了用(yong)乙(yi)醇(chun)外(wai)還可用(yong) 1 倍(bei)(bei)體(ti)積(ji)丙(bing)醇(chun)(相當(dang)于 2 倍(bei)(bei)體(ti)積(ji)乙(yi)醇(chun))使 DNA 沉淀。用(yong)異丙(bing)醇(chun)的(de)好處

是要求離心的液(ye)體(ti)體(ti)積小(xiao),但異丙醇揮發性(xing)不如乙醇,zui、終除(chu)區其殘留部分的難度更大(da)。

此外,異丙醇(chun)能促(cu)使蔗糖、氯化鈉等溶質與 DNA 一(yi)起沉(chen)淀,在-70℃時(shi),更易發生,所以

一(yi)

般以乙醇(chun)沉(chen)淀為宜,除非(fei)要求液體體積很小(xiao)。

7.影響質粒 DNA 提(ti)純質量和產率因(yin)素(su)的(de)說明(ming)。

(1)菌株

質粒(li)的(de)(de)宿主菌菌株的(de)(de)不(bu)同對質粒(li) DNA 純化的(de)(de)質量和(he)產(chan)率很大(da)。一般zui、好(hao)選用 enA 基因

突變的(de)宿主菌(jun),即 enA-菌株,如 DH5α,JMl09 和 XL1—Blue 等。使川含野生型 enA 基因

的菌株會影響質(zhi)粒(li) DNA 的純度(du)。

enA 基因是核酸(suan)內切酶 I。核酸(suan)內切酶 I 是一(yi)種 12kDa 的壁膜蛋白,受鎂離子激活,可被

EDTA 抑制,對(dui)熱敏感。雙鏈 DNA 是(shi)核酸內切酶(mei) I 的底物,但 RNA 是(shi)該酶(mei)的競爭性抑制

劑.能(neng)改變酶的(de)(de)特(te)異性(xing),使其由(you)水解(jie)產(chan)生 7 個堿基的(de)(de)寡(gua)聚核苷酸的(de)(de)雙鏈 DNA 內切酶活(huo)性(xing),

變為平均每底物(wu)每次切(qie)割一次的(de)切(qie)口酶(mei)活性。核酸內切(qie)酶(mei) I 的(de)功能仍不清楚(chu),enA 基因突變

的(de)菌株沒(mei)有明顯的(de)表現改變(bian),但(dan)質(zhi)粒(li)產量及穩定性明顯提高。細菌不同(tong)生長期核酸內切酶 I

表達水平(ping)不(bu)同(tong)。生(sheng)長(chang)的指數期(qi)較穩定(ding)期(qi)核酸內切酶 I 水平(ping)高 300 倍。此外,培養基中促進(jin)快

速生(sheng)長(chang)的成分如高葡萄糖水及補(bu)充氨基(ji)酸都會使核酸內切酶 I 水平增(zeng)高。

此外,菌株的其他性質有時(shi)也(ye)應加(jia)以考慮。如 XL1—Blue 生長速度(du)較慢(man)。,HBl01 及(ji)其衍

生菌株如(ru) TG1 及 JMl00 序(xu)列,含大量的糖(tang),這些糖(tang)如(ru)果在質粒純化過程(cheng)中不除(chu)去,在菌體(ti)

裂解后釋放(fang)出來,可能抑(yi)制酶活性。

(2)質粒的拷貝數

細(xi)菌中(zhong)質(zhi)粒的拷貝數是影響(xiang)質(zhi)粒產量的zui、主(zhu)要(yao)的因素。質(zhi)粒的拷貝數主(zhu)要(yao)由復制(zhi)起點

(replication origin)如 pMBl 及 pSC101 及其附近的 DNA 序列決定(ding)。這些被稱作復制點的

區域通(tong)過細菌的(de)酶復(fu)合物控制(zhi)(zhi)質(zhi)粒 DNA 的(de)復(fu)制(zhi)(zhi)。當插進(jin)一些特殊(shu)的(de)載體時,能降(jiang)低質(zhi)粒的(de)

拷貝數。此外(wai),太大的 DNA 插入也(ye)能(neng)使質粒(li)拷貝數下降。一些質粒(li),如 pUC 序列,由于經過(guo)

了突變和(he)改造,在細菌細胞內的(de)拷貝(bei)數很大.以 pBR322 質粒(li)為(wei)基礎的(de)質粒(li)拷貝(bei)數較低,粘

粒(li)(cosmid)及特(te)別大的質(zhi)粒(li)通常拷貝數(shu)極低(表 1)。

表 I 各種質(zhi)粒(li)和粘(zhan)粒(li)的復制(zhi)起點(dian)和拷(kao)貝數

載體(ti) 復制起點 拷(kao)貝數 特點

質(zhi)粒

pUC 載體 ColE1 500~700 高拷貝

pBluescript 載體 ColE1 300~500 高(gao)拷貝

pGEM 載體 pMB1 300~400 高拷貝

pTZ 載體(ti) pMB1 >1000 高拷貝(bei)

pBR322 及其衍生質粒 pMB1 15~20 低拷貝

pACYC 及其衍生質粒 p15A 1O~12 低拷貝

psc101 及其衍生(sheng)質粒 psc101 ~5 極低拷貝(bei)

粘粒

SuperCos ColE1 10~20 低拷貝

PWE15 ColE1 10~20 低拷貝

(3)細(xi)菌培養(yang)

用于制備質(zhi)粒(li)的細菌培養應該從(cong)選擇(ze)性培養的平板(ban)中挑(tiao)取(qu)單個菌落培養。不應該直接從(cong)

甘(gan)油保存菌,半固體培養(yang)基及液體培養(yang)基中挑菌,這可(ke)能導致質粒丟失。也(ye)不該從(cong)長期(qi)保存

的平板上直接挑菌,這也可能使(shi)質粒突變或使(shi)質粒丟(diu)失。挑取單個菌落至 3ml 選(xuan)擇性(xing)培養基

中,培養(yang)至飽(bao)和(he)狀態(tai)(12~14 小時)就可進(jin)行小量(liang)質粒提取。

8.除了本實驗采用(yong)的小量質粒 DNA 提(ti)取法外,很(hen)多生物試(shi)劑公司還提(ti)供試(shi)劑盒用(yong)于(yu)小

量質粒 DNA 的提取。通常情況下.采用試劑(ji)盒都(dou)能獲得較高質量的 DNA,所得到的 DNA

都可直接用于(yu)傳染、測序(xu)及(ji)限制酶(mei)分(fen)析等。下面介紹三種試劑盒。

A.用 Bio—Rad 質粒小量(liang)制備試劑盒提(ti)取質粒 DNA

(1)取過夜培(pei)養(yang)的菌液 l~2ml 至微離(li)心管中。離(li)心 30s 沉淀細胞,吸去所有上(shang)清。

(2)加 200μl 細胞(bao)懸(xuan)浮(fu)液(Cell Rcsuspension Solution) 并(bing)吹打數次(或旋渦振蕩),使沉淀(dian)

*懸浮(fu)。

(3)加 250μl 細胞裂解液(Cell Lysis Solution),輕輕顛倒管 l0 次(ci)(不旋渦(wo)振(zhen)蕩)如果(guo)細胞裂

解了,溶液應變得粘稠且(qie)稍清亮。如(ru)果仍然渾(hun)濁(zhuo),繼續混合(he)。

(4)加(jia) 250μl 中和液(Neuralization Solution),輕(qing)輕(qing)顛倒管 10 次(不旋渦振蕩)混合(此時

應該形成(cheng)可見沉淀)。

(5)在微(wei)(wei)離心機上以zui、高轉(zhuan)速(12 000~14 000g)沉淀細胞碎(sui)片 5min。在管底(di)或沿著管壁

有緊(jin)密白色沉淀。 (6)將一支(zhi)過濾柱(Spin Filter)插(cha)在一支(zhi)新離心管(guan)上。

(7)直接吸(xi) 200μl 基質(zhi)懸液(Quantum Prep Matrix)到含(han)白(bai)色沉淀的管中(吸(xi)基質(zhi)中成份(fen)

前(qian),*混合基質(zhi)),為避免(mian)管壁有沉淀,吹(chui)吸 2 次混合,立(li)即直(zhi)接將懸液倒(dao)在過濾柱(zhu)(Spin

Filter)內(nei),當(dang)所有樣品轉(zhuan)移到過濾柱內(nei)后,離心 30s。

(8)從(cong)微離心管(guan)上(shang)移開過(guo)濾(lv)柱,棄(qi)去離心管(guan)底的(de)濾(lv)液(ye)。

(9)再放(fang)過濾柱到同(tong)一管上。加 500μl 洗滌液(ye)(Wash Solution)洗滌基質(第1次使用前

加 63ml 95%乙醇到洗滌液中(zhong)),離心 30s。

(10)從微離(li)心(xin)管(guan)上移開過(guo)濾(lv)柱(zhu),棄去(qu)離(li)心(xin)管(guan)底(di)的濾(lv)液,再(zai)放過(guo)濾(lv)柱(zhu)到同一(yi)管(guan)上。

(11)加 500μl 洗(xi)滌液(ye)洗(xi)滌基(ji)質(zhi),離心 2nun,除去(qu)殘(can)存的乙醇。移開過濾(lv)柱,棄去(qu)離心

管。

(12)放(fang)過濾柱在(zai)一新離(li)(li)心管上,加 100μl 去離(li)(li)子水或 TE,離(li)(li)心 30s 洗脫 DNA。棄去過濾

柱,將洗脫的 DNA 保存在-20℃。

B.用泛特津公司(si)的日常型質粒(li) DNA 小量(liang)制備試(shi)劑盒(he)提取(qu)質粒(li) DNA

(1)取 5ml 過夜培養的菌液,用臺(tai)式離(li)心(xin)機zui、高速度離(li)心(xin) lmin,棄盡上清。

(2)加(jia)(jia)入 250μlS1 溶(rong)液懸浮細菌(jun),加(jia)(jia)入 250 山(shan) S2 溶(rong)液,混和但充分地(di)上下混合均勻 3~4

次(ci)。

(3)加 400μl 4℃預(yu)冷的 S3 溶液,溫和但充(chong)分地上下(xia)混合均勻.靜(jing)置 2min。

(4)將溶(rong)液連同凝結塊一起轉入到(dao)微量(liang)濾器中,1000r/min 離心 30s,使溶(rong)液直(zhi)接過濾到(dao)

2ml 離心管中。

(5)將過(guo)濾液從(cong) 2ml 離心管中轉入到 DNA 小量制備(bei)管中,3600r/min 離心 lmin。

(6)棄(qi) 2ml 離心管中溶液.將 DNA 小(xiao)量(liang)制(zhi)備(bei)管重(zhong)新置回到 2ml 離心管中。

(7)加 500μl W1 溶(rong)液,3600r/min 離心(xin) 1min,棄(qi) 2ml 離心(xin)管中溶(rong)液,將 DNA 小量制

備管重新置回到 2ml 離(li)心(xin)管中。

(6)加 650μl S5 溶液,3600r/min 離心 lmin。

(9)將 DNA 制備(bei)管移人(ren)另一 2ml 離心管中(zhong),再加 650μl S5 溶液,1200r/min 離心

2min。

(10)將小量制備(bei)管(guan)移到(dao) 1.5ml 離心管(guan)上,加 60μl 65℃預熱的(de) TE 緩沖液于 DNA 結合(he)膜

中間,室溫(wen)下置(zhi) lmin,1200r/min,離心 1min,洗脫質(zhi)粒 DNA。

C.用 Qiegan 質粒(li) DNA 小量制備(bei)試(shi)劑(ji)盒(he)(P1asmid Mini Kit)提取質粒(li) DNA

試劑盒(he)組(zu)成

質粒提取試(shi)劑盒(he)(Plasmid Kits) 小量(liang) 25 次(ci)(Mini 25) 小量(liang) 100 次(ci)(mini 100)

廠家(jia)目錄號(Catalog No.) 12123 12125

純化柱(QIAGEN—tip 20) 25 100

Pl 緩沖液(Buffer,P1) 20ml 40ml

P2 緩(huan)沖液(Buffer,P2) 20ml 40ml

P3 緩(huan)沖液(Buffer, P3) 20ml 40mlQBT 緩(huan)沖液(Buffer QBT) 40ml 110ml

QC 緩沖液(ye)(Buffer QC) 120ml 480ml

QF 緩沖液(Buffer QF) 30ml 110ml

RNase A(100mg/ml) 2mg 4mg

使用手冊(ce)(Handbook) 1 1

實驗步驟(zou)

(1)取 3nd 過夜培養的菌液,用臺式離心機zui、高(gao)速度(du)離心,棄去上清(qing)。沉淀用 0.3ml 含(han)

Rnase A 的 P1 緩沖液(Buffer P1)溶解。

注(zhu):P1 緩沖(chong)液(ye)在使用前(qian)應該加人試劑盒(he)中提供(gong)的(de) RNase A 溶液(ye).Rnase A 溶液(ye)加入

P1 緩(huan)沖液(ye)前.可先短時(shi)高速離心至管(guan)底。含 Rnase A 的(de) P1 緩(huan)沖液(ye)可于 2~8℃保存(cun) 6 個

月.

(2)加 0.3m1 P2 緩沖液(Buffer P2),輕輕顛(dian)倒管 4~6 次混勻(不要旋(xuan)渦振蕩),室溫放

置(zhi) 5 min。

注(zhu):裂解反(fan)應時間不要大(da)干 5 min。P2 緩沖液(ye)開(kai)蓋取完試(shi)劑后.立即重新;旋上蓋

子(zi).以(yi)免試劑中的(de) NaOH 與空氣中的(de) CO2反應。

(3)加 0.3ml 預冷的(de) P3 緩沖(chong)液(Buffer P3),立即輕輕顛倒管(guan)

(4)再次混勻樣品,在臺式離(li)心機上以zui、大轉(zhuan)速(su)(10 000—13 0OOr/ min 或 14 000~18

000r/ min)離心 10 min,移(yi)出(chu)上清,

注(zhu):離心后,上(shang)(shang)清應該時清亮的.如果上(shang)(shang)清不清亮,再(zai)次(ci)離心至上(shang)(shang)清清亮,不清亮的成

分將堵(du)塞(sai)柱子(zi),使流(liu)速清亮。

(5)用 lml QBT 緩沖液(Buffer QBT)平衡 QIAGEN—tip 20,讓補上液體自然(以(yi)重(zhong)力)

流(liu)干。

(6)向 QIAGEN-tip 20 柱(zhu)上(shang)加入步 4 收(shou)集的上(shang)清,讓上(shang)清自(zi)然(以重力)流人(ren)柱(zhu)中(zhong)。

上清(qing)盡快加人到柱中.如(ru)果(guo)存放時(shi)間太久.由于蛋(dan)白質沉淀變混,上樣前應(ying)重新離心,

以免(mian)堵(du)塞(sai)柱

(7)用 4 X 1ml,緩沖(chong)液(Buffer QC)洗滌 QIAGEN—tip 20 柱。 ‘

(8)用 O.8ml 緩(huan)沖(chong)液(ye)(Buffer QF)洗(xi)脫(tuo) DNA。

(9)用 0.7 體積(0.8ml 洗脫流(liu)出液則為 0.56ml)室(shi)溫(wen)放置(zhi)的異(yi)丙(bing)醇沉淀(dian)離心機上≥10 000r

/min 離心(xin) 30 min,小(xiao)心(xin)倒出上清。

(10)用 1ml 70%乙醇(chun)洗(xi)滌 DNA,空氣(qi)干燥 5 min,以適當(dang)體積緩沖液重新溶解(jie)

DNA。

試劑

(1)P1 緩沖(chong)液(ye)(菌體重懸緩沖(chong)液(ye)):50mmol/l Tris-HCl,pH8.0;10mmol/L EDTA;100

/μg/ml RnaseA 4℃保存。

配制(zhi)方(fang)法:Tris 6.06 g,EDTA·2H2O 3.72 g,用 800ml ddH2O 溶(rong)解,用 HCl 調 pH

至 8.0 加 ddH2O 至(zhi) 1000 ml。1000 ml P1 緩沖液中加入 100 mg RNaseA。

(2)P2 緩(huan)沖液(裂解(jie)緩(huan)沖液):200mmol/L NaOH,1%SDS。室溫保(bao)存。配制方(fang)法:NaOH 8.0g 溶(rong)于 950ml ddH2O 中(zhong),加入(ru) 50 ml 20%SDS 溶液加 ddH2O

至 1000 ml。

(3)P3 緩沖(chong)液(中和緩沖(chong)液):3.0mmo]/L 乙酸鉀,pH5.5。室(shi)溫或 4℃保存

配(pei)制方法:乙(yi)酸鉀 294.5g 溶于 500 ml ddH3O 中,用冰乙酸(約(yue) 110m1)調 pH 至(zhi) 5.5

加 ddH2O 至 1000 ml。

(4)QBT 緩沖液(平衡緩沖液):750mmol/L NaCl; 50mmol/L MOPS,pH7.O;15%異

丙(bing)醇(chun);0.15%Triton X—100。室溫保存(cun)。

配(pei)制(zhi)方法:NaCl 43.83g,MOPS(自由酸(suan))10.46g 溶(rong)于 860ml ddH2O。調 pH 至(zhi) 7.0。

加(jia)(jia) 150 ml 純異丙醇及 15 ml lO% TritonX—100 溶液,加(jia)(jia) ddH2O 至 1000ml。

(5)QC 緩沖液(ye)(沖洗緩沖液(ye)):1.0mmol/L NaCl;50mmol/L MOPS,pH7.0;15%

異丙醇。室溫保存。

配制方法:NaCl 58.44g;MOPS(自由酸)10.46g 溶于 800 ml ddH2O 。調 pH7.0。加

150ml 純(chun)異丙醇,加 ddH2O 至(zhi) 1000ml。

(6)QF 緩(huan)沖(chong)液(ye)(洗脫(tuo)緩(huan)沖(chong)液(ye)):1.25mol/L NaCl;50mmol/L Tris HCl,pH8.5;15%異(yi)

丙醇(chun)。室溫保存。

配制方法:NaCl 73.05g,Tris 6.06g,溶于(yu) 800ml ddH2O。用(yong) HCl 凋 pH 至

8.5。加(jia) 150ml 純異丙(bing)醇,加(jia) ddH2O 至 1000ml。

(7)TE:10mmol/L Tris-HCl,pH8.O,1mmol/L EDTA。室溫保(bao)存。

(8)STE:100mmol/L NaCl,10mmol/L Tris-HCl,pH8.0,1mmol/L EDTA。室

溫保存(cun)。

配制方法:NaCl 5.84g,Tris 1.21g,EDTA·2H2O 0.37g,溶于 800ml ddH20 中,用(yong)

HCl 調 pH8.0,加 ddH2O 至 1000ml。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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