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質粒 DNA 的提取

更新時間:2019-03-20瀏覽:3484次

質粒 DNA 的提取

一、原理

采用堿變性發抽提取質粒 DNA。該法是基于染色體 DNA 與質粒 DNA 的變性預復性的

差異而達到分離目的的。在 PH 大于 12 的堿性條件下,染色體 DNA 的氫鍵斷裂,雙螺旋

結構解開變性。質粒 DNA 的大部分氫鍵也斷裂,但超螺旋共價閉合環狀結構的兩條互補鏈

不會*分離,當以 pH5.2 的乙酸鈉高鹽緩沖液調節其 pH 至中性時,變性的質粒 DNA 又

恢復到原來的構型,保存在溶液中。而染色體 DNA 不能復性而形成纏連的網狀結構。通過

離心,染色體 DNA 與不穩定的大分子 RNA,蛋白質-SDS 復合物等一起沉淀下來而被除

去。

二、方法

1. 挑取一環在 LB 固體培養基平板上生長的含 PUC57 質粒的大腸桿菌,接在含有 100μ

g/ml 氨芐青霉素(Amp)的 LB 液體培養基(5ml/15ml 試管)中,37℃震搖培養過

夜。

2. 將 1.5ml 菌液加入微離心管中,14000r/min,離心 10 秒,其取上清液。反復數次,收

集全部菌體。

3. 傾去上清,濾紙吸干。

4. 加 30μlTE 緩沖液(10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0),振蕩起菌體。

5. 加 30μlTENS 溶液(10mmol/L Tris—HCl, pH8.0,1mmol/L EDTA,0.1mol/L

NaOH,0.5%SDS),震蕩 10 秒至溶液變粘稠。

6. 加 150μl 3.0mol/LnaAC,震蕩 3—5S,14000r/min,離心 3 分鐘,沉淀細胞碎片及染

色體 DNA。

7. 上清液轉移至另一微離心管中,甲等體積胞和酚,混勻,12000r/min,離心 2 分鐘。

8. 上層水相轉移至另一位離心管,加 2 倍量冷水乙醇,14000r/min,離心 20 分鐘。

9.傾去乙醇,加入 7o%冷乙醇淋洗。

10.傾去乙醇,濾紙吸于,真空抽吸 2~3 分鐘。

lI.加人 50μlTE 緩沖液,溶解 DNA。

12,加入 1μl 核糖核酸酶(10mg/m1),14000r/min,離心 2s,使核糖核酸酶與管底液體混

勻。

13.37℃水浴 30min。

14.樣品放一 20℃冰箱保存備用。

三、試劑

1.TE 緩沖液(10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0)

配制方法:

Tris 1.211g

EDTA.Na 0.037g

用 800ml 重蒸水溶解,用分析純鹽酸調整 pH 至 8.0,加重蒸水定容至 1000ml。

2.TENS 溶液:(10mmol/L Tris—HCl, pH8.0,1mmol/L EDTA,0.1mol/L

NaOH,0.5%SDS) 配制方法:

NaOH O.4 g

SDS 0.5 g

加 80mlTE 緩沖液溶解。加 TE 緩沖液定容至 lOOml.

3.3.0mol/1 醋酸鈉溶液(pH5.2)

配制方法:醋酸鈉 24.6g

用 70ml 重蒸水溶解,再用冰乙酸大約調 pH 至 5.2,加重蒸水定容至 100ml。

純凈的酚使用時不需要重蒸。市售的酚一般為紅色或黃色結晶體,使用之前必須重蒸,除去

能引起 DNA 和 RNA 斷裂和聚合的雜質。將苯酚置于 65℃水浴中溶解,重新進行蒸餾,當

溫度升至 183℃時,開始收集在若干個棕色瓶中。純酚和重蒸酚都應貯存在-20℃使用前取

一瓶重蒸酚于分液漏斗中,加入等體積的 lmol/L Tris-HCI(pH8.0)緩沖液,立即加蓋,激

烈振蕩,并加入固體 Tris 搖勻調 pH(一般 100ml 苯酚約加 l 克固體 Tris)分層后測上層水相

pH 至 7.6 一 8.0。從分液漏斗中放出下層酚相于棕色瓶中,并加一定體積 0.1mol/L Tris

HCI(pH8.o)覆蓋在酚相上,置 4℃冰箱貯存備用。酚是一種強腐蝕劑,能引起腐蝕性損

傷,操作時應戴上眼鏡和手套。如果皮膚上濺上了酚,應用大量水沖洗或用肥皂水沖洗。酚

在空氣極易氧化變紅,要隨時加蓋,也可加入抗氧化劑 o.1%8 一羥基喹啉及 o.2%β—

巰基乙醇。

5.無水乙醇

置-20℃冰箱中保存備用

6.70%乙醇

置-20℃冰箱中保存備用

7.核糖核酸酶(10mg/ml)

配制方法:稱取 l0mg 核糖核酸酶 A(RNaseA,美國 SIGMA 或中科院上海生物化學研

究所東風試劑廠)。于滅菌的微離心管內,加 1 ml 100mmol/pH5.0 的 NaAC 溶液(*溶

解),即為 10mg/ml RNase,為了破壞脫氧核糖核酸酶(DNase,置 80℃水浴中 10min 或

100℃水浴 2 min,然后置一 20℃(或家用冰箱的冰格內)保存。

四、材料

1.菌種:

大腸桿菌(pUC57)

2.培養基

LB 液體培養基

精解蛋白胨 3g

酵母浸出粉 1.5g

氯化鈉 3 g

葡萄糖 0.6g 按上述配方用重蒸水(ddH2O 或 dH2O 表示,下同)溶解至 300ml。用 10mol/LnaOH

調

pH 至 7.2~7.4。分裝于 15ml 試管中,每支 5ml。然后置高壓蒸汽消毒鍋以 1.1kg/

cm2 滅菌 20min.

l 抗菌素:

氨芐青霉素(Amp)臨用時用無菌水配制在無菌有蓋試管中,濃度為 100mg/m1。

五、儀器:

恒溫振蕩器。

低溫冰箱-20℃

真空泵。

臺式高速離心機

六、說明

1.質粒 DNA 提取的方法很多,有堿變性法、羥基磷灰石柱層析法、溴化乙錠一氯化銫

梯度超離心法等。本次實驗是一種小量快速提取法。小量快速提取法也有多種,但基本原理

和步驟是一致的.包括下述步驟:(1)裂解菌體細胞;(2)質粒和染色體 DNA 的分離;(3)除

去蛋白質。RNA 及其他影響限制性酶活性的細胞成分;(4)除去提璣過程中使用的去垢劑、

等。

2.在基因操作實驗中.保存或提取 DNA 過程中,一般都采用 TE 緩沖液,而不選用其它

的緩沖液。雖然很多緩沖系統.如磷酸鹽緩沖系統,硼酸系統都符合細胞內環境的生理范

圍,可以作為 DNA 的保存液,但在某些實驗中,這些緩沖對會影響實驗。如在轉化實驗

中,要用到 Ca+,如果川磷酸鹽緩沖液,磷酸根將與 Ca2+產生 Ca(PO4+沉淀;在各種工具

酶反應時,不同的酶對輔助因子的種類及數量要求不同,有的要求高鹽離子濃度,有的則要

求低鹽濃度,采用 Tris—HCI 緩沖系統,不存在金屬離子的干擾作用;作中的 EDTA 是二價

離子

Mg2+、Ca2+等的螯合劑,可降低系統中的這些離子濃度,而這些離產是脫氧核糖核酸酶的

助因子,所以 EDTA 可以抑制脫氧核糖核酸酶對 DNA 的降解作用。

3、TENS 中 NaOH:核酸在 pH 大于 5,小于 9 的溶液中穩定,怛當 pH 大于 12 或小于 3

時,就會引起 DNA 兩條鏈之間氫鍵的解離而變性。TENS 中有 NaOH 使其 pH 大于 12,

因而

使染色體 DNA 與質粒 DNA 變性。

TENS 中的 SDS:SDS 是離子型表面活性劑。它主要功能有:(1)溶解細胞膜上的脂肪與

蛋白質,因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜;(2)解聚細胞中的核蛋白;(3)SDS 能與蛋白質結合

成為 R1 一 O 一 SO3…R2+一蛋白質的復合物,使蛋白質變性而沉淀下來。但是 SDS 能抑制

糖核酸酶的作用,所以在以后的提取過程中,必須把它去干凈,防止在下一步操作中(用Rnase 去除 RNA 時)受干擾。

4、3.0mol/L NaAC(pH5.2)使 pH 大于 12 的 DNA 抽提液回到中性,使變性的質粒

DNA

能夠復性,并能穩定存在。染色體 DNA 不能復性(染色體 DNA 不存在超螺旋共價閉合環結

構) 而高鹽的 3mol/L NaAC 有利于變性的大分子染色體 DNA、RNA、以及 SDS—蛋白質

復合物凝聚沉淀。pH5.2 也能中和核酸上的電荷,減少相互斥力而互相聚合。同時,鈉鹽

能與

SDS 一蛋白質復合物作用后,形成溶解度較小的鈉鹽形式復合物,使沉淀更*。

5.飽和酚:酚是一種表面變性劑,屬非極性分子。水是極性分子。當蛋白質溶液與酚混

合合時,蛋白質分子之間的水分子被酚擠走,使蛋白質失去水合狀態而變性。經過離心。變

性蛋白質的密度比水的密度大,因而與水相分離,沉淀在水相下面,酚比重更大,保留在zui、

下層。酚作為變性劑.也有一些缺點:(1)酚與水有一定程度的互溶,酚相中水的溶解可達大

約 10%~15%,溶解在這部分水相中有 DNA 會損失,(2)酚很容易氧化,變成粉紅色,氧

化的酚容易降解 DNA,解決酚氧化和帶水的辦法是將酚重蒸,除去氧化的部分,再用 Tris

—HCl 緩沖液飽和,使酚不至于奪去 DNA 中的水,帶走部分 DNA。飽和酚中加上 8 一羥

基硅啉及巰基乙醇,防止酚氧化,還是弱的螫合劑.可抑制 DNase。由于有顏色.溶解在

酚中后,使酚帶上

顏色,便于酚相與水相的分肉,酚飽和后,表面蓋上一層 Tris 水溶液,隔絕空氣,阻止酚氧

化。

6.關于無水乙醇沉淀 DNA 的說明:

用無水乙醇沉淀 DNA,是實驗中zui、常用的沉淀 DNA 的方法。乙醇的優點是具有極性,

可以以任意比例和水相混溶,乙醇與核酸不會起化學反應,對 DNA 很安全,因此是理想的

淀劑。

乙醇之所以能沉淀 DNA,是由于 DNA 溶液是以水合狀態穩定存在的 DNA,當加入乙

醇.乙醇會奪去 DNA 周圍的水分子,使 DNA 失水而易于聚合沉淀,一般實驗中,用 2 倍

體積

的無水乙醇與 DNA 相混合。使乙醇的zui、終含量占 67%左右。由此可預見,也可用 95%乙

沉淀 DNA,但是用 95%乙醇使總體積增大.而 DNA 在醇溶液中總有一定程度的溶解。因

DNA 損失也增大,影響收率。

乙醇沉淀 DNA 溶液時,DNA 溶液中應該有一定的鹽濃度,中和 DNA 表面電荷。如果溶

液中鹽濃度太低,要加 NaAC 或 NaCl 至zui、終濃度 O.1 一 O.25mol/l 在 pH 8 左右的 DNA

溶液中,DNA 分子帶負電荷,加一定濃度的 NaAC 或 NaCl 使 Na+中和 DNA 分子上的負

電荷,減少 DNA 分子之間的同性電荷相斥力,易于互相聚合而形成 DNA 鈉鹽沉淀。當加

入的鹽溶液濃度太低時。只有部分 DNA 形成 DNA 鈉鹽而聚合,這樣就造成 DNA 沉淀不*。但當加入的鹽溶液濃度太高時,其效果也不好,在沉淀的 DNA 中,由于過多的鹽雜

質存在,影響 DNA 的酶切等反應,必須進行洗滌或重沉淀。

乙醇沉淀 DNA.一般采用低溫條件,這是由于在低溫條件下.分子運動大大減少,DNA

易于聚合而沉淀。為了使質粒 DNA 能充分沉淀,一般保存時間總是過長的,同時也要視樣

品的體積而異,在微量離心管中的樣品要比 40 毫升離心管中 DNA 樣品的量少,冷卻就較

迅速。大量提取 DNA 時,目前習慣上常采用如下幾種方法:

保存在家用冰箱結冰盒內 過夜

保存在-2℃亡冰箱內 過夜

保存在-70℃冰箱內 30mm~2h

放置干冰中(約-20℃) 30min

放置干冰加酒精中(約-70℃) 16mm

放置在液氮缸中液氮的氣相內,不可以浸在液氮中(溫度在-198℃左右)5~15min。

除了用乙醇外還可用 1 倍體積丙醇(相當于 2 倍體積乙醇)使 DNA 沉淀。用異丙醇的好處

是要求離心的液體體積小,但異丙醇揮發性不如乙醇,zui、終除區其殘留部分的難度更大。

此外,異丙醇能促使蔗糖、氯化鈉等溶質與 DNA 一起沉淀,在-70℃時,更易發生,所以

般以乙醇沉淀為宜,除非要求液體體積很小。

7.影響質粒 DNA 提純質量和產率因素的說明。

(1)菌株

質粒的宿主菌菌株的不同對質粒 DNA 純化的質量和產率很大。一般zui、好選用 enA 基因

突變的宿主菌,即 enA-菌株,如 DH5α,JMl09 和 XL1—Blue 等。使川含野生型 enA 基因

的菌株會影響質粒 DNA 的純度。

enA 基因是核酸內切酶 I。核酸內切酶 I 是一種 12kDa 的壁膜蛋白,受鎂離子激活,可被

EDTA 抑制,對熱敏感。雙鏈 DNA 是核酸內切酶 I 的底物,但 RNA 是該酶的競爭性抑制

劑.能改變酶的特異性,使其由水解產生 7 個堿基的寡聚核苷酸的雙鏈 DNA 內切酶活性,

變為平均每底物每次切割一次的切口酶活性。核酸內切酶 I 的功能仍不清楚,enA 基因突變

的菌株沒有明顯的表現改變,但質粒產量及穩定性明顯提高。細菌不同生長期核酸內切酶 I

表達水平不同。生長的指數期較穩定期核酸內切酶 I 水平高 300 倍。此外,培養基中促進快

速生長的成分如高葡萄糖水及補充氨基酸都會使核酸內切酶 I 水平增高。

此外,菌株的其他性質有時也應加以考慮。如 XL1—Blue 生長速度較慢。,HBl01 及其衍

生菌株如 TG1 及 JMl00 序列,含大量的糖,這些糖如果在質粒純化過程中不除去,在菌體

裂解后釋放出來,可能抑制酶活性。

(2)質粒的拷貝數

細菌中質粒的拷貝數是影響質粒產量的zui、主要的因素。質粒的拷貝數主要由復制起點

(replication origin)如 pMBl 及 pSC101 及其附近的 DNA 序列決定。這些被稱作復制點的

區域通過細菌的酶復合物控制質粒 DNA 的復制。當插進一些特殊的載體時,能降低質粒的

拷貝數。此外,太大的 DNA 插入也能使質粒拷貝數下降。一些質粒,如 pUC 序列,由于經過

了突變和改造,在細菌細胞內的拷貝數很大.以 pBR322 質粒為基礎的質粒拷貝數較低,粘

粒(cosmid)及特別大的質粒通常拷貝數極低(表 1)。

表 I 各種質粒和粘粒的復制起點和拷貝數

載體 復制起點 拷貝數 特點

質粒

pUC 載體 ColE1 500~700 高拷貝

pBluescript 載體 ColE1 300~500 高拷貝

pGEM 載體 pMB1 300~400 高拷貝

pTZ 載體 pMB1 >1000 高拷貝

pBR322 及其衍生質粒 pMB1 15~20 低拷貝

pACYC 及其衍生質粒 p15A 1O~12 低拷貝

psc101 及其衍生質粒 psc101 ~5 極低拷貝

粘粒

SuperCos ColE1 10~20 低拷貝

PWE15 ColE1 10~20 低拷貝

(3)細菌培養

用于制備質粒的細菌培養應該從選擇性培養的平板中挑取單個菌落培養。不應該直接從

甘油保存菌,半固體培養基及液體培養基中挑菌,這可能導致質粒丟失。也不該從長期保存

的平板上直接挑菌,這也可能使質粒突變或使質粒丟失。挑取單個菌落至 3ml 選擇性培養基

中,培養至飽和狀態(12~14 小時)就可進行小量質粒提取。

8.除了本實驗采用的小量質粒 DNA 提取法外,很多生物試劑公司還提供試劑盒用于小

量質粒 DNA 的提取。通常情況下.采用試劑盒都能獲得較高質量的 DNA,所得到的 DNA

都可直接用于傳染、測序及限制酶分析等。下面介紹三種試劑盒。

A.用 Bio—Rad 質粒小量制備試劑盒提取質粒 DNA

(1)取過夜培養的菌液 l~2ml 至微離心管中。離心 30s 沉淀細胞,吸去所有上清。

(2)加 200μl 細胞懸浮液(Cell Rcsuspension Solution) 并吹打數次(或旋渦振蕩),使沉淀

*懸浮。

(3)加 250μl 細胞裂解液(Cell Lysis Solution),輕輕顛倒管 l0 次(不旋渦振蕩)如果細胞裂

解了,溶液應變得粘稠且稍清亮。如果仍然渾濁,繼續混合。

(4)加 250μl 中和液(Neuralization Solution),輕輕顛倒管 10 次(不旋渦振蕩)混合(此時

應該形成可見沉淀)。

(5)在微離心機上以zui、高轉速(12 000~14 000g)沉淀細胞碎片 5min。在管底或沿著管壁

有緊密白色沉淀。 (6)將一支過濾柱(Spin Filter)插在一支新離心管上。

(7)直接吸 200μl 基質懸液(Quantum Prep Matrix)到含白色沉淀的管中(吸基質中成份

前,*混合基質),為避免管壁有沉淀,吹吸 2 次混合,立即直接將懸液倒在過濾柱(Spin

Filter)內,當所有樣品轉移到過濾柱內后,離心 30s。

(8)從微離心管上移開過濾柱,棄去離心管底的濾液。

(9)再放過濾柱到同一管上。加 500μl 洗滌液(Wash Solution)洗滌基質(第1次使用前

加 63ml 95%乙醇到洗滌液中),離心 30s。

(10)從微離心管上移開過濾柱,棄去離心管底的濾液,再放過濾柱到同一管上。

(11)加 500μl 洗滌液洗滌基質,離心 2nun,除去殘存的乙醇。移開過濾柱,棄去離心

管。

(12)放過濾柱在一新離心管上,加 100μl 去離子水或 TE,離心 30s 洗脫 DNA。棄去過濾

柱,將洗脫的 DNA 保存在-20℃。

B.用泛特津公司的日常型質粒 DNA 小量制備試劑盒提取質粒 DNA

(1)取 5ml 過夜培養的菌液,用臺式離心機zui、高速度離心 lmin,棄盡上清。

(2)加入 250μlS1 溶液懸浮細菌,加入 250 山 S2 溶液,混和但充分地上下混合均勻 3~4

次。

(3)加 400μl 4℃預冷的 S3 溶液,溫和但充分地上下混合均勻.靜置 2min。

(4)將溶液連同凝結塊一起轉入到微量濾器中,1000r/min 離心 30s,使溶液直接過濾到

2ml 離心管中。

(5)將過濾液從 2ml 離心管中轉入到 DNA 小量制備管中,3600r/min 離心 lmin。

(6)棄 2ml 離心管中溶液.將 DNA 小量制備管重新置回到 2ml 離心管中。

(7)加 500μl W1 溶液,3600r/min 離心 1min,棄 2ml 離心管中溶液,將 DNA 小量制

備管重新置回到 2ml 離心管中。

(6)加 650μl S5 溶液,3600r/min 離心 lmin。

(9)將 DNA 制備管移人另一 2ml 離心管中,再加 650μl S5 溶液,1200r/min 離心

2min。

(10)將小量制備管移到 1.5ml 離心管上,加 60μl 65℃預熱的 TE 緩沖液于 DNA 結合膜

中間,室溫下置 lmin,1200r/min,離心 1min,洗脫質粒 DNA。

C.用 Qiegan 質粒 DNA 小量制備試劑盒(P1asmid Mini Kit)提取質粒 DNA

試劑盒組成

質粒提取試劑盒(Plasmid Kits) 小量 25 次(Mini 25) 小量 100 次(mini 100)

廠家目錄號(Catalog No.) 12123 12125

純化柱(QIAGEN—tip 20) 25 100

Pl 緩沖液(Buffer,P1) 20ml 40ml

P2 緩沖液(Buffer,P2) 20ml 40ml

P3 緩沖液(Buffer, P3) 20ml 40mlQBT 緩沖液(Buffer QBT) 40ml 110ml

QC 緩沖液(Buffer QC) 120ml 480ml

QF 緩沖液(Buffer QF) 30ml 110ml

RNase A(100mg/ml) 2mg 4mg

使用手冊(Handbook) 1 1

實驗步驟

(1)取 3nd 過夜培養的菌液,用臺式離心機zui、高速度離心,棄去上清。沉淀用 0.3ml 含

Rnase A 的 P1 緩沖液(Buffer P1)溶解。

注:P1 緩沖液在使用前應該加人試劑盒中提供的 RNase A 溶液.Rnase A 溶液加入

P1 緩沖液前.可先短時高速離心至管底。含 Rnase A 的 P1 緩沖液可于 2~8℃保存 6 個

月.

(2)加 0.3m1 P2 緩沖液(Buffer P2),輕輕顛倒管 4~6 次混勻(不要旋渦振蕩),室溫放

置 5 min。

注:裂解反應時間不要大干 5 min。P2 緩沖液開蓋取完試劑后.立即重新;旋上蓋

子.以免試劑中的 NaOH 與空氣中的 CO2反應。

(3)加 0.3ml 預冷的 P3 緩沖液(Buffer P3),立即輕輕顛倒管

(4)再次混勻樣品,在臺式離心機上以zui、大轉速(10 000—13 0OOr/ min 或 14 000~18

000r/ min)離心 10 min,移出上清,

注:離心后,上清應該時清亮的.如果上清不清亮,再次離心至上清清亮,不清亮的成

分將堵塞柱子,使流速清亮。

(5)用 lml QBT 緩沖液(Buffer QBT)平衡 QIAGEN—tip 20,讓補上液體自然(以重力)

流干。

(6)向 QIAGEN-tip 20 柱上加入步 4 收集的上清,讓上清自然(以重力)流人柱中。

上清盡快加人到柱中.如果存放時間太久.由于蛋白質沉淀變混,上樣前應重新離心,

以免堵塞柱

(7)用 4 X 1ml,緩沖液(Buffer QC)洗滌 QIAGEN—tip 20 柱。 ‘

(8)用 O.8ml 緩沖液(Buffer QF)洗脫 DNA。

(9)用 0.7 體積(0.8ml 洗脫流出液則為 0.56ml)室溫放置的異丙醇沉淀離心機上≥10 000r

/min 離心 30 min,小心倒出上清。

(10)用 1ml 70%乙醇洗滌 DNA,空氣干燥 5 min,以適當體積緩沖液重新溶解

DNA。

試劑

(1)P1 緩沖液(菌體重懸緩沖液):50mmol/l Tris-HCl,pH8.0;10mmol/L EDTA;100

/μg/ml RnaseA 4℃保存。

配制方法:Tris 6.06 g,EDTA·2H2O 3.72 g,用 800ml ddH2O 溶解,用 HCl 調 pH

至 8.0 加 ddH2O 至 1000 ml。1000 ml P1 緩沖液中加入 100 mg RNaseA。

(2)P2 緩沖液(裂解緩沖液):200mmol/L NaOH,1%SDS。室溫保存。配制方法:NaOH 8.0g 溶于 950ml ddH2O 中,加入 50 ml 20%SDS 溶液加 ddH2O

至 1000 ml。

(3)P3 緩沖液(中和緩沖液):3.0mmo]/L 乙酸鉀,pH5.5。室溫或 4℃保存

配制方法:乙酸鉀 294.5g 溶于 500 ml ddH3O 中,用冰乙酸(約 110m1)調 pH 至 5.5

加 ddH2O 至 1000 ml。

(4)QBT 緩沖液(平衡緩沖液):750mmol/L NaCl; 50mmol/L MOPS,pH7.O;15%異

丙醇;0.15%Triton X—100。室溫保存。

配制方法:NaCl 43.83g,MOPS(自由酸)10.46g 溶于 860ml ddH2O。調 pH 至 7.0。

加 150 ml 純異丙醇及 15 ml lO% TritonX—100 溶液,加 ddH2O 至 1000ml。

(5)QC 緩沖液(沖洗緩沖液):1.0mmol/L NaCl;50mmol/L MOPS,pH7.0;15%

異丙醇。室溫保存。

配制方法:NaCl 58.44g;MOPS(自由酸)10.46g 溶于 800 ml ddH2O 。調 pH7.0。加

150ml 純異丙醇,加 ddH2O 至 1000ml。

(6)QF 緩沖液(洗脫緩沖液):1.25mol/L NaCl;50mmol/L Tris HCl,pH8.5;15%異

丙醇。室溫保存。

配制方法:NaCl 73.05g,Tris 6.06g,溶于 800ml ddH2O。用 HCl 凋 pH 至

8.5。加 150ml 純異丙醇,加 ddH2O 至 1000ml。

(7)TE:10mmol/L Tris-HCl,pH8.O,1mmol/L EDTA。室溫保存。

(8)STE:100mmol/L NaCl,10mmol/L Tris-HCl,pH8.0,1mmol/L EDTA。室

溫保存。

配制方法:NaCl 5.84g,Tris 1.21g,EDTA·2H2O 0.37g,溶于 800ml ddH20 中,用

HCl 調 pH8.0,加 ddH2O 至 1000ml。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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