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染色質免疫共沉淀(ChIP)

更新時間:2019-03-20瀏覽:2192次

染色質免疫共沉淀(ChIP)

染色質免疫共沉淀可以:(1)組蛋白修飾酶的抗體作為“生物標記”;(2)轉錄調控分

析;(3)藥物開發研究;(4)DNA 損失與凋亡分析。

1 實驗方法原理:

在保持組蛋白和 DNA 聯合的同時,通過運用對應于一個特定組蛋白標記的生物抗體,染色

質被切成很小的片斷,并沉淀下來。

IP 是利用抗原蛋白質和抗體的特異性結合以及細菌蛋白質的“prorein A”特異性地結合到

免疫球蛋白的 FC 片段的現象活用開發出來的方法。

目前多用精制的 prorein A 預先結合固化在 argarose 的 beads 上,使之與含有抗原的溶液

及抗體反應后,beads 上的 prorein A 就能吸附抗原達到精制的目的。

2 實驗材料、試劑、儀器耗材:

細胞樣品

甲醛、甘氨酸、PBS、SDS、 Lysis Buffer、洗脫液、RNaseA、蛋白酶 K、omega 膠回收

試劑盒等

離心管、超聲儀、電泳儀、離心機等

3 實驗步驟:

一、細胞的甲醛交聯與超聲破碎( 第1天)

1. 取出 1 平皿細胞(10 cm 平皿),加入 243 ul 37%甲醛,使得甲醛的終濃度為 1%(培

養基共有 9 ml)。

2. 37℃孵育 10 min。

3. 終止交聯:加甘氨酸至終濃度為 0.125 M。450 ul 2.5 M 甘氨酸于平皿中。混勻后,在

室溫下放置 5 min 即可。4. 吸盡培養基,用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 次。

5. 細胞刮刀收集細胞于 15 ml 離心管中(PBS 依次為 5 ml,3 ml 和 3 ml)。預冷后 2 000

rpm 5 min 收集細胞。

6. 倒去上清。按照細胞量,加入 SDS Lysis Buffer。使得細胞終濃度為每 200ul 含 2×106

個細胞。這樣每 100 ul 溶液含 1×106 個細胞。再加入蛋白酶抑制劑復合物。假設 MCF7

長滿板為 5×106 個細胞。本次細胞長得約為 80%。即為 4×106 個細胞。因此每管加入 400

ul SDS Lysis Buffer。將 2 管混在一起,共 800 ul。

7. 超聲破碎:VCX750,25%功率,4.5 s 沖擊,9 s 間隙。共 14 次。

二、除雜及抗體哺育 ( 第1天)

1. 超聲破碎結束后,10 000 g 4℃離心 10 min。去除不溶物質。

2. 留取 300ul 做實驗,其余保存于-80℃。

3. 300 ul 中,100 ul 加抗體做為實驗組;100 ul 不加抗體做為對照組;100 ul 加入 4 ul 5

M NaCl(NaCl 終濃度為 0.2 M),65℃處理 3 h 解交聯,跑電泳,檢測超聲破碎的效果。

4. 在 100 ul 的超聲破碎產物中,加入 900 ul ChIP DilutionBuffer 和 20 ul 的 50×PIC。

再各加入 60 ul ProteinA Agarose/SalmonSpermDNA。4℃顛轉混勻 1 h。

5. 1 h 后,在 4℃靜置 10 min 沉淀,700 rpm 離心 1 min。

6. 取上清。各留取 20 ul 做為 input。一管中加入 1 ul 抗體,另一管中則不加抗體。4℃顛

轉過夜。

三、檢驗超聲破碎的效果 ( 第1天)

1. 取 100 ul 超聲破碎后產物,加入 4 ul 5M NaCl,65℃處理 2 h 解交聯。

2. 分出一半用酚/氯fang抽提。電泳檢測超聲效果。

四、免疫復合物的沉淀及清洗( 第二天)1. 孵育過夜后,每管中加入 60 ul ProteinA Agarose/SalmonSperm DNA。4℃顛轉 2 h。

2. 4℃靜置 10 min 后,700 rpm 離心 1 min。除去上清。

3. 依次用下列溶液清洗沉淀復合物。清洗的步驟:加入溶液,在 4℃顛轉 10 min,4℃靜

置 10 min 沉淀,700 rpm 離心 1 min,除去上清。

洗滌溶液:

(1)low salt wash buffer-one wash

(2)highsalt wash buffer-one wash

(3)LiCl wash buffer-one wash

(4)TE buffer-two wash

4. 清洗完畢后,開始洗脫。

洗脫液的配方:100 ul 10%SDS,100 ul1M NaHCO3,800 ul ddH2O,共 1 ml。

每管加入 250 ul 洗脫 buffer,室溫下顛轉 15 min,靜置離心后,收集上清。重復洗滌一

次。終的洗脫液為每管 500 ul。

5. 解交聯:每管中加入 20 ul 5M NaCl(NaCl 終濃度為 0.2 M)。

6. 混勻,65℃解交聯過夜。

五、DNA 樣品的回收(第三天)

1. 解交聯結束后,每管加入 1 ul RNaseA(MBI),37℃孵育 1 h。

2. 每管加入 10 ul 0.5 M EDTA,20 ul1M Tris.HCl(PH6.5),2 ul 10 mg/ml 蛋白酶 K。

45℃處理 2 h。

3. DNA的片段的回收----omega 膠回收試劑盒。終的樣品溶于 100 ul ddH2O。

六、PCR 分析(第三天)ChIP-chip 技術對于大規模挖掘順式調控信息成績*,同時它可以用于胚胎干細胞和一些

疾病如癌癥、心血管疾病和中央神經紊亂的發生的機制。研究人員還可以利用這項技術開發

一些治療方法。目前 ChIP-chip 技術研究主要集中于兩個領域:及轉錄因子的結合和條件

特異性;組蛋白的修飾,組蛋白修飾蛋白和染色體重建。

ChIP-chip 在描述轉錄結合因子動力學中的研究、染色體結構組分的分布、在組蛋白的修飾、

組蛋白修飾蛋白和染色體重建中的應用也十分廣泛。ChIP-chip 技術的優點是,可以在體

內進行反應;在給定的檢驗細胞環境的模式下得到 DNA 相互關系的簡單影像;使用特異性

修正抗體鑒定與包含有一個特異性后轉錄修正的蛋白質的相關位點;直接或者間接(通過蛋

白質與蛋白質的相互作用)的鑒別基因組與蛋白質的相關位點。缺點是:需要一個特異性蛋

白質抗體,有時難于獲得;為了獲得高豐度的結合片段,必須實驗演示胞內條件下靶標蛋白

質的表達情況;調控蛋白質的基因的獲取可能需要限制在組織來源中。

總之,ChIP-chip 技術的發展為析活細胞或組織中 DNA 與蛋白質的相互關系提供了一個極

為有力的工具。在未來的研究中,將對芯片的構建進行改進,提高其實用性。使用易于獲得

抗體,增加這種方法的可用性。

在 PCR 分析這一塊,比較傳統的做法是半定量-PCR。但是現在隨著熒光定量 PCR 的普及,

大家也越來越傾向于 Q-PCR 了。此外還有一些由 ChIP 衍生出來的方法。例如 RIP(其實

就是用 ChIP 的方法研究細胞內蛋白與 RNA 的相互結合,具體方法和 ChIP 差不多,只是實

驗過程中要注意防止 RNase,后分析的時候需要先將 RNA 逆轉錄成為 cDNA);還有

ChIP-chip(其實就是 ChIP 富集得到的 DNA-片段,拿去做芯片分析,做法在 ChIP 的基礎

上有所改變,不同的公司有不同的做法,要根據公司的要求來準備樣品)。

4 注意事項:1. 注意抗體的性質。抗體不同和抗原結合能力也不同,免染能結合未必能用在 IP 反應。建

議仔細檢查抗體的說明書。特別是多抗的特異性是問題。

2. 注意溶解抗原的緩沖液的性質。多數的抗原是細胞構成的蛋白,特別是骨架蛋白,緩沖

液必須要使其溶解。為此,必須使用含有強界面活性劑的緩沖液,盡管它有可能影響一部分

抗原抗體的結合。另一面,如用弱界面活性劑溶解細胞,就不能充分溶解細胞蛋白。即便溶

解也產生與其它的蛋白結合的結果,抗原決定族被封閉,影響與抗體的結合,即使 IP 成功,

也是很多蛋白與抗體共沉的悲慘結果。

3. 為防止蛋白的分解,修飾,溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑,低溫下進行實驗。

每次實驗之前,首先考慮抗體/緩沖液的比例。抗體過少就不能檢出抗原,過多則就不能沉

降在 beads 上,殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原,過多則抗原被稀釋。

5 其他:

一、染色質免疫共沉淀簡介

真核生物的基因組 DNA 以染色質的形式存在。因此,研究蛋白質與 DNA 在染色質環境下

的相互作用是闡明真核生物基因表達機制的基本途徑。染色質免疫沉淀技術(chromatin

immunoprecipitation assay, CHIP)是目前唯1研究體內 DNA 與蛋白質相互作用的方法。

它的基本原理是在活細胞狀態下固定蛋白質-DNA 復合物,并將其隨機切斷為一定長度范

圍內的染色質小片段,然后通過免疫學方法沉淀此復合體,特異性地富集目的蛋白結合的

DNA的片段,通過對目的片斷的純化與檢測,從而獲得蛋白質與 DNA 相互作用的信息。CHIP

不僅可以檢測體內反式因子與 DNA 的動態作用,還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與

基因表達的關系。而且,CHIP 與其他方法的結合,擴大了其應用范圍:CHIP 與基因芯片

相結合建立的 CHIP-on-chip 方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選;CHIP 與

體內足跡法相結合,用于尋找反式因子的體內結合位點;RNA-CHIP 用于研究 RNA 在基因表達調控中的作用。由此可見,隨著 CHIP 的進一步完善,它必將會在基因表達調控研究中

發揮越來越重要的作用。

二、ChIP 的一般流程

甲醛處理細胞---收集細胞,超聲破碎---加入目的蛋白的抗體,與靶蛋白-DNA 復合物相互

結合---加入 ProteinA,結合抗體-靶蛋白-DNA 復合物,并沉淀---對沉淀下來的復合物進

行清洗,除去一些非特異性結合---洗脫,得到富集的靶蛋白-DNA 復合物---解交聯,純化

富集的 DNA-片斷---PCR 分析。

 

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