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染色質免疫共沉淀(ChIP)

更新(xin)時間:2019-03-20瀏覽:2309次(ci)

染色質(zhi)免疫共沉淀(ChIP)

染色質(zhi)免(mian)疫(yi)共(gong)沉淀可以:(1)組蛋(dan)白(bai)修飾酶的(de)抗體作為“生物標記(ji)”;(2)轉錄(lu)調控分

析;(3)藥物開發研究;(4)DNA 損失與凋亡(wang)分(fen)析。

1 實驗方法原理:

在(zai)保持組蛋(dan)白和(he) DNA 聯合的同時(shi),通過運用(yong)對應于一個特定組蛋(dan)白標(biao)記的生物抗(kang)體,染色

質被切(qie)成很小的片斷,并(bing)沉淀下來(lai)。

IP 是利用抗原蛋白質(zhi)和抗體的特(te)異性結(jie)(jie)合(he)以(yi)及細菌蛋白質(zhi)的“prorein A”特(te)異性地結(jie)(jie)合(he)到

免疫球蛋白的 FC 片段的現象活用開發出(chu)來的方法。

目(mu)前多(duo)用精(jing)制(zhi)的(de) prorein A 預先結合(he)固(gu)化在 argarose 的(de) beads 上,使之與含有(you)抗(kang)原的(de)溶液

及抗(kang)(kang)體反應后(hou),beads 上的(de)(de) prorein A 就能吸附抗(kang)(kang)原達到精制的(de)(de)目的(de)(de)。

2 實驗材(cai)料、試劑、儀(yi)器(qi)耗材(cai):

細胞(bao)樣(yang)品

甲醛、甘氨酸(suan)、PBS、SDS、 Lysis Buffer、洗(xi)脫液、RNaseA、蛋白酶 K、omega 膠回收

試劑盒等

離心(xin)管、超聲儀、電泳儀、離心(xin)機(ji)等

3 實驗步驟:

一、細胞的(de)甲醛交聯與超聲破碎( 第1天)

1. 取出(chu) 1 平(ping)皿(min)細胞(10 cm 平(ping)皿(min)),加入 243 ul 37%甲醛,使(shi)得(de)甲醛的終(zhong)濃(nong)度為 1%(培

養基(ji)共有 9 ml)。

2. 37℃孵育 10 min。

3. 終止交聯:加甘氨酸至終濃度為 0.125 M。450 ul 2.5 M 甘氨酸于平皿中。混(hun)勻后,在

室溫(wen)下(xia)放(fang)置 5 min 即可。4. 吸盡培養基,用冰冷的 PBS 清洗細胞 2 次。

5. 細(xi)胞刮刀收(shou)集細(xi)胞于 15 ml 離(li)心管(guan)中(PBS 依(yi)次(ci)為(wei) 5 ml,3 ml 和 3 ml)。預(yu)冷后 2 000

rpm 5 min 收集細(xi)胞。

6. 倒去上清。按照細胞量,加入 SDS Lysis Buffer。使得細胞終濃度為(wei)每 200ul 含 2×106

個(ge)細胞。這樣每 100 ul 溶液含 1×106 個(ge)細胞。再加入(ru)蛋白酶抑制劑復(fu)合物(wu)。假設 MCF7

長(chang)滿板為(wei)(wei) 5×106 個細(xi)胞(bao)。本次(ci)細(xi)胞(bao)長(chang)得約為(wei)(wei) 80%。即為(wei)(wei) 4×106 個細(xi)胞(bao)。因此(ci)每(mei)管加入(ru) 400

ul SDS Lysis Buffer。將 2 管混(hun)在(zai)一起,共 800 ul。

7. 超(chao)聲破碎:VCX750,25%功(gong)率,4.5 s 沖擊,9 s 間隙。共 14 次。

二、除(chu)雜及抗體哺(bu)育 ( 第1天)

1. 超聲破(po)碎結束(shu)后,10 000 g 4℃離心(xin) 10 min。去除不(bu)溶物質。

2. 留取(qu) 300ul 做實(shi)驗,其余保存于-80℃。

3. 300 ul 中,100 ul 加抗體做(zuo)為實(shi)驗(yan)組(zu);100 ul 不(bu)加抗體做(zuo)為對照(zhao)組(zu);100 ul 加入 4 ul 5

M NaCl(NaCl 終濃(nong)度為 0.2 M),65℃處理(li) 3 h 解交(jiao)聯,跑電泳,檢測超聲破碎(sui)的(de)效(xiao)果(guo)。

4. 在 100 ul 的超聲破碎產物中,加(jia)入(ru) 900 ul ChIP DilutionBuffer 和 20 ul 的 50×PIC。

再(zai)各(ge)加入 60 ul ProteinA Agarose/SalmonSpermDNA。4℃顛轉(zhuan)混勻(yun) 1 h。

5. 1 h 后(hou),在 4℃靜置 10 min 沉淀,700 rpm 離心 1 min。

6. 取上清。各留取 20 ul 做為 input。一管(guan)中加入 1 ul 抗體,另一管(guan)中則不加抗體。4℃顛(dian)

轉過(guo)夜。

三、檢驗超(chao)聲破碎的效果 ( 第1天)

1. 取(qu) 100 ul 超聲(sheng)破碎后產物,加入 4 ul 5M NaCl,65℃處(chu)理 2 h 解交聯。

2. 分出一(yi)半(ban)用酚/氯fang抽提。電泳檢測超(chao)聲效果。

四(si)、免疫復合(he)物的(de)沉淀及清(qing)洗( 第二天)1. 孵育(yu)過夜后(hou),每(mei)管(guan)中加入 60 ul ProteinA Agarose/SalmonSperm DNA。4℃顛轉 2 h。

2. 4℃靜(jing)置 10 min 后(hou),700 rpm 離心 1 min。除去上清(qing)。

3. 依次用下(xia)列(lie)溶液清(qing)洗沉淀復合物(wu)。清(qing)洗的步(bu)驟:加(jia)入溶液,在 4℃顛(dian)轉 10 min,4℃靜

置(zhi) 10 min 沉(chen)淀(dian),700 rpm 離心 1 min,除去上清。

洗(xi)滌溶液:

(1)low salt wash buffer-one wash

(2)highsalt wash buffer-one wash

(3)LiCl wash buffer-one wash

(4)TE buffer-two wash

4. 清洗(xi)完畢后,開(kai)始洗(xi)脫。

洗(xi)脫液(ye)的配方(fang):100 ul 10%SDS,100 ul1M NaHCO3,800 ul ddH2O,共(gong) 1 ml。

每(mei)管加入 250 ul 洗脫(tuo) buffer,室溫下(xia)顛轉 15 min,靜(jing)置離(li)心(xin)后(hou),收(shou)集上清(qing)。重復洗滌(di)一

次。終的洗脫液為(wei)每管(guan) 500 ul。

5. 解(jie)交聯:每管中加入 20 ul 5M NaCl(NaCl 終(zhong)濃度為 0.2 M)。

6. 混勻,65℃解交聯過(guo)夜。

五、DNA 樣品的(de)回收(第三天(tian))

1. 解交聯結束后(hou),每管加入 1 ul RNaseA(MBI),37℃孵(fu)育 1 h。

2. 每管加入 10 ul 0.5 M EDTA,20 ul1M Tris.HCl(PH6.5),2 ul 10 mg/ml 蛋白酶 K。

45℃處理 2 h。

3. DNA的(de)(de)片段的(de)(de)回收----omega 膠回收試劑盒(he)。終的(de)(de)樣品溶于 100 ul ddH2O。

六、PCR 分析(xi)(第三天(tian))ChIP-chip 技術對于(yu)大(da)規(gui)模挖掘順式調控信息(xi)成績*,同時它可以用于(yu)胚胎干細胞和(he)一些

疾(ji)病如(ru)癌癥、心血管疾(ji)病和(he)中央神經紊亂的發生(sheng)的機制。研究人員還可以利用這項技術開(kai)發

一些治療方法。目前 ChIP-chip 技(ji)術研究主要集中于兩個領域:及(ji)轉錄(lu)因子的結合和條件

特異性;組(zu)蛋(dan)白(bai)的修飾(shi),組(zu)蛋(dan)白(bai)修飾(shi)蛋(dan)白(bai)和染色體重建。

ChIP-chip 在描述轉錄(lu)結(jie)(jie)合因(yin)子動力(li)學中的(de)研究、染色(se)體結(jie)(jie)構組分的(de)分布、在組蛋白的(de)修飾、

組蛋(dan)白修飾蛋(dan)白和染色體(ti)重建中的應(ying)用也(ye)十分(fen)廣泛。ChIP-chip 技(ji)術(shu)的優點是,可以在體(ti)

內進行反應;在(zai)給定的檢(jian)驗細胞環境的模式下得到 DNA 相互關(guan)系的簡單影像;使用特異性

修正抗體鑒定與包含有一個(ge)特異性后(hou)轉錄修正的(de)蛋白質的(de)相關位點;直接或者(zhe)間(jian)接(通(tong)過蛋

白質(zhi)與蛋白質(zhi)的(de)相互(hu)作用)的(de)鑒別基因組與蛋白質(zhi)的(de)相關位點。缺點是:需(xu)要一個(ge)特異(yi)性蛋

白(bai)質(zhi)抗體,有時難于(yu)獲得;為(wei)了獲得高豐度的結(jie)合片(pian)段(duan),必須實驗演示(shi)胞內條件下(xia)靶標(biao)蛋白(bai)

質的表達情況;調控(kong)蛋白質的基因的獲取(qu)可能需要限制在組(zu)織來源中。

總之,ChIP-chip 技(ji)術的發展為(wei)析活細胞或組織(zhi)中 DNA 與蛋白質的相互關系提供了一個極(ji)

為有力的(de)工(gong)具。在未來(lai)的(de)研究(jiu)中,將對芯片的(de)構建進行改進,提高其實用(yong)(yong)性。使用(yong)(yong)易于獲得

抗體,增加(jia)這種方法的可用性。

在 PCR 分析這(zhe)一塊,比較傳統的做(zuo)法是(shi)半定(ding)量(liang)-PCR。但是(shi)現(xian)在隨(sui)著熒光(guang)定(ding)量(liang) PCR 的普(pu)及,

大家也越來越傾向于 Q-PCR 了。此外還有一些由 ChIP 衍(yan)生出來的方(fang)法。例如(ru) RIP(其(qi)實

就是(shi)(shi)用(yong) ChIP 的方法(fa)研究細胞內蛋白與(yu) RNA 的相互結合,具體方法(fa)和 ChIP 差(cha)不多(duo),只是(shi)(shi)實

驗(yan)過程中要注意防止 RNase,后分析的時(shi)候需要先將 RNA 逆(ni)轉錄成(cheng)為(wei) cDNA);還有(you)

ChIP-chip(其實就(jiu)是 ChIP 富集得到的 DNA-片段,拿去做芯片分析,做法(fa)在 ChIP 的基礎

上有(you)(you)所改變,不同的公司(si)有(you)(you)不同的做法,要(yao)根據公司(si)的要(yao)求來準備樣(yang)品)。

4 注意事項:1. 注意(yi)抗(kang)體(ti)的(de)性質(zhi)。抗(kang)體(ti)不同(tong)和抗(kang)原結合能力也不同(tong),免染能結合未必(bi)能用在 IP 反應。建

議(yi)仔細檢查抗體的說明書。特別是(shi)多抗的特異性是(shi)問題。

2. 注意溶解(jie)抗原(yuan)的(de)(de)緩沖液的(de)(de)性質。多(duo)數的(de)(de)抗原(yuan)是細胞構成的(de)(de)蛋(dan)白,特別是骨(gu)架(jia)蛋(dan)白,緩沖

液必須(xu)要使其溶解。為此,必須(xu)使用含有(you)強(qiang)界面活(huo)性(xing)劑的(de)緩沖液,盡管它(ta)有(you)可能影響一部分

抗原抗體(ti)的結合(he)。另一面,如用弱界面活性(xing)劑溶解(jie)細(xi)胞,就不能充分溶解(jie)細(xi)胞蛋(dan)白。即便(bian)溶

解也產生與其它的蛋白結(jie)合的結(jie)果,抗(kang)原決(jue)定族被封閉,影響與抗(kang)體的結(jie)合,即使 IP 成功(gong),

也是很多蛋白與抗體(ti)共沉的悲慘結果(guo)。

3. 為防止蛋白的(de)分解(jie),修飾,溶(rong)解(jie)抗原的(de)緩沖液必(bi)須加蛋白每抑制(zhi)劑,低溫下進行(xing)實驗。

每次(ci)實(shi)驗(yan)之前(qian),首先(xian)考慮抗體/緩沖液的比例。抗體過(guo)少就不能檢(jian)出抗原,過(guo)多則就不能沉

降在 beads 上,殘存在上清。緩沖(chong)劑太少則(ze)不能溶解抗原,過多則(ze)抗原被稀(xi)釋。

5 其他:

一、染色質(zhi)免疫共沉淀簡介(jie)

真核生物的基因(yin)組(zu) DNA 以染(ran)色質(zhi)的形式存在。因(yin)此(ci),研究(jiu)蛋白質(zhi)與 DNA 在染(ran)色質(zhi)環境(jing)下

的(de)相(xiang)互作用是闡(chan)明真(zhen)核生物基(ji)因表(biao)達機制的(de)基(ji)本途徑。染色(se)質免疫沉(chen)淀技術(chromatin

immunoprecipitation assay, CHIP)是(shi)目前唯1研究體內 DNA 與(yu)蛋白質相互(hu)作用的方(fang)法。

它的基本原理(li)是在活細胞狀(zhuang)態下(xia)固定蛋白質-DNA 復(fu)合物,并將(jiang)其隨機切斷為一(yi)定長度范

圍內的(de)染色質小片段,然后(hou)通過免疫學方法沉淀此復合體,特(te)異(yi)性地富集目的(de)蛋白結合的(de)

DNA的片段,通過對目的片斷的純化與(yu)檢(jian)測,從而(er)獲(huo)得蛋白質與(yu) DNA 相互(hu)作用的信(xin)息(xi)。CHIP

不僅可以檢測(ce)體內反式因子與 DNA 的動(dong)態作用,還可以用來研究(jiu)組蛋(dan)白的各種共(gong)價修飾與

基因表達的(de)關系。而且,CHIP 與(yu)其他(ta)方法的(de)結合,擴(kuo)大了其應用范圍(wei):CHIP 與(yu)基因芯片

相(xiang)結合建立的(de) CHIP-on-chip 方(fang)法已廣(guang)泛用于特(te)定反式因子靶(ba)基因的(de)高通量篩(shai)選;CHIP 與

體內足跡法相結(jie)合(he),用于(yu)尋找反(fan)式因子的體內結(jie)合(he)位點(dian);RNA-CHIP 用于(yu)研究(jiu)(jiu) RNA 在基因表(biao)達(da)(da)調(diao)(diao)控中(zhong)的作用。由此可見,隨著 CHIP 的進一(yi)步完(wan)善,它必將(jiang)會在基因表(biao)達(da)(da)調(diao)(diao)控研究(jiu)(jiu)中(zhong)

發揮越(yue)來越(yue)重要(yao)的作用(yong)。

二、ChIP 的一般流程

甲醛處理(li)細(xi)胞---收集細(xi)胞,超聲破碎---加(jia)入目(mu)的(de)蛋白(bai)的(de)抗體,與靶蛋白(bai)-DNA 復合物(wu)相(xiang)互

結合(he)(he)---加入 ProteinA,結合(he)(he)抗體-靶(ba)蛋白-DNA 復合(he)(he)物,并沉(chen)(chen)淀---對沉(chen)(chen)淀下(xia)來的(de)復合(he)(he)物進(jin)

行清(qing)洗,除去一些(xie)非特異性結合(he)---洗脫,得到(dao)富(fu)集的靶(ba)蛋(dan)白(bai)-DNA 復合(he)物---解交聯,純化

富(fu)集的 DNA-片斷(duan)---PCR 分析。

 

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