熟妇高潮喷沈阳45熟妇高潮喷_人妻丰满熟妇av无码区乱_黑人人妻AV一区二区三_少妇太爽丰满一区二区

當前位置:首頁 > 技術文章 > 凝膠遷移實驗(EMSA)

凝膠遷移實驗(EMSA)

更新時(shi)間:2019-03-20瀏覽:2668次

凝膠遷移(yi)實驗(yan)(EMSA)

凝膠(jiao)遷移(yi)或電泳遷移(yi)率實驗(EMSA)可以(yi):(1)研究 DNA 結合蛋白和其(qi)相(xiang)關的 DNA 結

合序列相互作用(yong)(yong)(yong);(2)可用(yong)(yong)(yong)于 DNA 定性和(he)定量(liang)分析;(3)用(yong)(yong)(yong)于研究 RNA 結合蛋白和(he)特

定(ding)的(de) RNA 序列的(de)相互作用。

1 實驗方法和原(yuan)理

凝膠遷移或(huo)電泳遷移率實驗(EMSA-electrophoretic mobility shift assay)是(shi)一種研究

DNA 結(jie)合蛋(dan)白和(he)其(qi)相關(guan)的 DNA 結(jie)合序列相互作用的技術,可用于定性和(he)定量分析。這一(yi)

技術(shu)zui初用于研(yan)究 DNA 結合蛋(dan)白,目(mu)前已用于研(yan)究 RNA 結合蛋(dan)白和特定的 RNA 序列的

相互作用。

通常將(jiang)chunhua的蛋白和(he)細胞粗提ye和(he) 32P 同位素(su)標記的 DNA 或 RNA 探針一同保溫,在非變

性的聚丙烯凝膠電泳上,分(fen)離復(fu)(fu)合物和非結(jie)合的探針。DNA-復(fu)(fu)合物或 RNA-復(fu)(fu)合物比非結(jie)

合(he)的探針(zhen)移動得慢。同位素標記的探針(zhen)依研(yan)究的結合(he)蛋(dan)白的不(bu)同,可是(shi)雙鏈(lian)或者是(shi)單(dan)鏈(lian)。當

檢(jian)測如轉錄調控因(yin)子一類的 DNA 結(jie)合蛋白,可用(yong)chunhua蛋白,部(bu)分(fen)chunhua蛋白,或核細胞抽提(ti)

ye。在檢測 RNA 結合蛋(dan)(dan)白時,依據目的 RNA 結合蛋(dan)(dan)白的位置,可用chunhua或(huo)部(bu)分chunhua的蛋(dan)(dan)

白,也可用核(he)或(huo)胞質細胞抽提ye。競爭(zheng)實(shi)驗中采(cai)用含蛋(dan)白結合(he)序列(lie)的 DNA 或(huo) RNA的片段和

寡核苷酸片段(duan)(特異), 和其它非(fei)相關的片段(duan)(非(fei)特異),來確定 DNA 或 RNA 結合蛋白

的特異(yi)性。在(zai)競爭的特異(yi)和非特異(yi)片段的存在(zai)下,依據復合物的特點和強(qiang)度來確定(ding)特異(yi)結合。

2 實(shi)驗材料、試劑(ji)、儀器耗(hao)材

DNA 樣品(pin)[γ-32P]ATP、T4 多聚(ju)核苷(gan)酸激酶(mei)、Nuclease-Free Water、T4 多聚(ju)核苷(gan)酸激酶(mei)緩沖ye、

醋酸(suan)銨、TE、無水乙醇、TBE buffer、重蒸水、甲叉雙(shuang)丙烯酰胺(an)、丙烯酰胺(an)、甘油、過硫

酸銨、TEMED(四甲基乙二(er)胺)、EMSA Gel-Shift 結(jie)合緩沖ye、溴酚藍等(deng)

水浴(yu)鍋(guo)、PCR 儀、離心機、電泳(yong)儀、電泳(yong)槽等

3 實驗(yan)步驟

一、探針的(de)標(biao)記(ji)

1. 如下設(she)置探針標記的反應體(ti)系:

(1)待標記探針 (1.75 pmol/微升(sheng)) :2 微升(sheng)。

(2)T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) :1 微(wei)升。

(3)Nuclease-Free Water :5 微升(sheng)。

(4)[γ-32P]ATP(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml) :1 微升(sheng)。

(5)T4 Polynucleotide Kinase (5-10 u/微升(sheng)) :1 微升(sheng)。

(6)總體積:10 微升

(7)按照上述反(fan)應體系依次加(jia)(jia)入各種試劑,加(jia)(jia)入同位素后,Vortex 混勻,再加(jia)(jia)入 T4

Polynucleotide Kinase,混勻。

2. 使用水浴或 PCR 儀(yi),37℃反應 10 分鐘(zhong)。

3. 加入(ru) 1 微升(sheng)探針標(biao)記(ji)終止ye,混勻,終止探針標(biao)記(ji)反應。

4. 再加入 89 微升 TE,混勻。此時可以取(qu)少量探針用于(yu)檢測標(biao)記(ji)的效(xiao)率(lv)。通常標(biao)記(ji)的效(xiao)率(lv)

在 30%以(yi)上,即總放射性的(de) 30%以(yi)上標 記(ji)到了(le)探針上。為實(shi)驗簡便起見,通常不必測定

探(tan)針的(de)(de)標記(ji)效率。5. 標記(ji)好的(de)(de)探(tan)針立即使用,zui長使用時間一(yi)般不宜超過 3 天。標記(ji)好的(de)(de)探(tan)針可以(yi)保存(cun)

在-20℃。

二、 探(tan)針的(de)chunhua 

通常為實驗簡(jian)便起見,可以不必chunhua標記好的探針(zhen)。在(zai)有(you)些(xie)時候,chunhua后的探針(zhen)會(hui)改善 EMSA

的電泳結果。如需chunhua,可以(yi)按(an)照如 下步驟操作

1. 對于 100 微(wei)升標記好的(de)探針,加入(ru) 1/4 體積即 25 微(wei)升的(de) 5 M 醋酸銨,再加入(ru) 2 體積即

200 微(wei)升的無水乙醇,混勻。

2. 在-70℃至-80℃沉淀 1 小時,或在-20℃沉淀過夜(ye)。

3. 在 4℃,12 000 g-16 000 g 離心 30 分鐘。小心去除上(shang)清,切(qie)不可(ke)觸及沉。

4. 在 4℃,12 000 g-16 000 g 離心 1 分鐘(zhong)。小(xiao)心吸去殘余ye體。微(wei)晾干沉淀,但不宜過

分干燥。

5. 加(jia)入(ru) 100 微升 TE,*溶解沉淀(dian)。標記(ji)好(hao)的探針立(li)即使用,zui長使用時間一般不宜

超過 3 天。標記好(hao)的探針可以保存(cun)在(zai) -20℃。

三、EMSA 膠的配制(zhi)

1. 準備好倒(dao)膠的模(mo)具(ju)。可以使用常規的灌制蛋白(bai)電泳膠的模(mo)具(ju),或其它適當的模(mo)具(ju)。

選擇可(ke)以灌(guan)制較薄膠的模具,以便于干膠等(deng)后續操作。為得到更好(hao)的結(jie)果(guo),可(ke)以選擇可(ke)灌(guan)制

較大 EMSA 膠的模具。

2. 按(an)照如下配方(fang)配制 20 毫升 4%的(de)聚丙(bing)烯酰胺凝膠(注意:使用 29:1 等(deng)不(bu)同比(bi)例的(de) Acr/Bis

對結(jie)果影(ying)響(xiang)不大)。

(1)TBE buffer (10X): 1 毫(hao)升。

重蒸(zheng)水:16.2 毫升。

(2)39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v): 2 毫升。(3)80% 甘油: 625 微(wei)升。

(4)10% 過硫酸銨(an) (ammonium persulfate) :150 微升。

(5)TEMED :10 微(wei)升

3. 按照上(shang)述次序加(jia)入(ru)各個(ge)溶ye,加(jia)入(ru) TEMED 前先混(hun)勻(yun),加(jia)入(ru) TEMED 后立(li)即(ji)混(hun)勻(yun),并馬

上加入(ru)到制膠的模具中。避免產生氣泡, 并加上梳齒。如果發現非(fei)常容易形成氣泡,可以

把一塊制膠的(de)玻璃(li)板進行硅(gui)烷hua處(chu)理(li)。

四、EMSA 結合反應

1. 如(ru)下設置 EMSA 結合反應

陰性對照反應:

(1)Nuclease-Free Water :7 微升。

(2)EMSA/Gel-Shift 結合緩(huan)沖(chong)ye(5X) :2 微(wei)升(sheng)。

(3)細胞核(he)蛋白(bai)或chunhua的轉錄因子(zi): 0 微升。

(4)標(biao)記好的(de)探針 :1 微(wei)升。

(5)總體(ti)積 :10 微升。

樣品反應:

(1)Nuclease-Free Water :5 微(wei)升(sheng)。

(2)EMSA/Gel-Shift 結合緩沖ye(5X) :2 微升。

(3)細胞核(he)蛋白或(huo)chunhua的轉(zhuan)錄(lu)因(yin)子 :2 微(wei)升(sheng)。

(4)標記好的探針: 1 微升。

(5)總體(ti)積: 10 微(wei)升(sheng)。

探針冷競爭反應:

(1)Nuclease-Free Water :4 微(wei)升。(2)EMSA/Gel-Shift 結合緩沖ye(5X) :2 微(wei)升。

(3)細胞核蛋(dan)白或chunhua的轉錄因子: 2 微升。

(4)未標記(ji)的探針: 1 微(wei)升。

(5)標(biao)記(ji)好(hao)的探針(zhen): 1 微(wei)升。

(6)總體(ti)積 :10 微升。

突變(bian)探針的冷競(jing)爭反(fan)應:

(1)Nuclease-Free Water :4 微(wei)升。

(2)EMSA/Gel-Shift 結(jie)合(he)緩(huan)沖ye(5X) :2 微(wei)升。

(3)細(xi)胞(bao)核蛋白或chunhua的轉錄因(yin)子 :2 微升(sheng)。

(4)未標(biao)記的突變探針: 1 微升(sheng)。

(5)標記好的探針: 1 微(wei)升(sheng)。

(6)體積 :10 微升

Super-shift 反應(ying):

(1)Nuclease-Free Water:4 微(wei)升。

(2)EMSA/Gel-Shift 結(jie)合緩沖ye(5X) :2 微升。

(3)細胞(bao)核蛋白或chunhua的轉錄因子:2 微升。

(4)目的蛋白特異抗體 :1 微升。

(5)標記好的探針:1 微升。

(6)總(zong)體積 :10 微(wei)升。

2. 按照上述(shu)順序依次加入(ru)各種試劑,在加入(ru)標記好的探(tan)針前先混勻,并且室溫(20-25℃)

放置 10 分鐘,從而消除可能發(fa)生的(de)探(tan)針和蛋白的(de)非(fei)特異性結合,或者讓冷探(tan)針優先(xian)反(fan)應(ying)。

然后加入標記好(hao)的探(tan)針,混(hun)勻(yun),室(shi)溫(20-25℃)放置 20 分鐘(zhong)。3. 加入 1 微升 EMSA/Gel-Shift 上(shang)樣緩沖(chong)ye(無色,10X),混(hun)勻(yun)后立即上(shang)樣。注意:有些時

候溴酚藍會影(ying)響蛋白和 DNA 的結合(he),建(jian) 議盡量使用(yong)無色的 EMSA/Gel-Shift 上樣緩(huan)沖ye。

如果(guo)對于使用無(wu)(wu)色上(shang)樣緩(huan)沖(chong)ye在上(shang)樣時(shi)感覺(jue)到無(wu)(wu)法(fa)上(shang)樣,可以在無(wu)(wu)色上(shang)樣緩(huan)沖(chong)ye里(li)面添加(jia)極

少量的(de)藍(lan)色的(de)上樣(yang)緩沖ye,至能觀(guan)察(cha)到藍(lan)顏色即可。

五、 電泳分析(xi)

1. 用(yong) 0.5XTBE 作為(wei)電(dian)泳ye。按照(zhao) 10V/厘米的電(dian)壓預(yu)電(dian)泳 10 分鐘。預(yu)電(dian)泳的時候(hou)如果有空

余的(de)上樣(yang)孔(kong),可以(yi)加(jia)入少(shao)量稀釋好(hao)的(de) 1X 的(de) EMSA 上樣(yang)緩沖ye(藍色),以(yi)觀察電壓是(shi)否正常

進行。

2. 把(ba)混合了上(shang)(shang)樣(yang)緩(huan)沖(chong)ye的(de)樣(yang)品加入到上(shang)(shang)樣(yang)孔(kong)(kong)內。在(zai)多余的(de)某個上(shang)(shang)樣(yang)孔(kong)(kong)內加入 10 微(wei)升稀(xi)釋好(hao)

的(de) 1X 的(de) EMSA/Gel-Shift 上樣緩沖ye (藍色),用于(yu)觀(guan)察(cha)電泳(yong)進行(xing)的(de)情況。

3. 按照 10 V/厘米(mi)的(de)電壓電泳。確保膠(jiao)的(de)溫(wen)度(du)不超過 30℃,如果(guo)溫(wen)度(du)升(sheng)高(gao),需要適當(dang)降低

電壓。電泳(yong)至(zhi) EMSA/Gel-Shift 上樣緩 沖ye中(zhong)的(de)藍色染料溴(xiu)酚藍至(zhi)膠的(de)下緣 1/4 處,停止

電泳。

4. 剪一片(pian)大小(xiao)和 EMSA 膠(jiao)大小(xiao)相近或(huo)略大的比較(jiao)厚實的濾紙。小(xiao)心取下夾有 EMSA 膠(jiao)的膠(jiao)

板(ban),用(yong)吸水紙或普(pu)通草紙大致擦(ca)干膠板(ban)邊 緣的電壓ye。小心打(da)開兩塊膠板(ban)中的上面一塊(注:

通常選擇先移走硅(gui)烷(wan)hua的那塊玻璃(li)板),把濾紙從EMSA膠(jiao)的一側(ce)逐漸覆(fu)蓋住整個EMSA膠(jiao),

輕(qing)輕(qing)把濾(lv)紙和膠(jiao)壓緊。濾(lv)紙被膠(jiao)微(wei)(wei)微(wei)(wei)浸濕后(hou)(大約不(bu)足(zu) 1 分鐘),輕(qing)輕(qing)揭起濾(lv)紙,這時 EMSA

膠會被濾紙一起(qi)揭起(qi)來。把濾紙側向下,放(fang)平,在 EMSA 膠的上面覆蓋一層保鮮膜(mo),確保

保鮮膜(mo)和膠之間(jian)沒有氣(qi)泡。

5. 干膠儀器上干燥 EMSA 膠。然后用 X 光片壓片檢測(ce)(ce),或(huo)用其它(ta)適當(dang)儀器設備檢測(ce)(ce)。

4 常見問題分析(xi)1. 什么是凝(ning)膠(jiao)遷移(yi)或(huo)電泳遷移(yi)率實驗?

凝膠遷移或電泳(yong)遷移率(lv)實驗(EMSA)是一種研究 DNA 結(jie)合(he)蛋白和其相關的 DNA 結(jie)合(he)序

列(lie)相互作用(yong)的技術(shu),可用(yong)于定(ding)性和(he)定(ding)量分(fen)析。這一技術(shu)zui初用(yong)于研究 DNA 結(jie)合蛋(dan)白,目前

已用于研究 RNA 結合蛋(dan)白和特定(ding)的 RNA 序(xu)列的相互作用。

通常將chunhua的(de)蛋白和細(xi)胞粗提ye和 32P 同(tong)位素標記的(de) DNA 或 RNA 探針(zhen)一同(tong)保溫(wen),在非變

性的(de)聚(ju)丙烯凝(ning)膠電泳上,分離(li)復(fu)合物(wu)和非結(jie)合的(de)探針。DNA 復(fu)合物(wu)或 RNA 復(fu)合物(wu)比非結(jie)

合的(de)(de)探針移動得慢。同位素標記的(de)(de)探針依研究的(de)(de)結合蛋(dan)白的(de)(de)不同,可(ke)是雙鏈(lian)或者是單(dan)鏈(lian)。當

檢測如(ru)轉錄調控因子一類的 DNA 結(jie)合蛋白,可用chunhua蛋白,部分chunhua蛋白,或核細胞抽提

ye。在檢測 RNA 結合蛋白(bai)時,依據(ju)目的(de)(de) RNA 結合蛋白(bai)的(de)(de)位置,可用chunhua或部分chunhua的(de)(de)蛋

白,也可用(yong)核或(huo)胞質細胞抽提ye。競爭實驗中采(cai)用(yong)含蛋白結合(he)序列的 DNA 或(huo) RNA的片段和

寡核苷酸(suan)片段(duan)(duan)(特異(yi)),和其它非相(xiang)關的片段(duan)(duan)(非特異(yi)),來(lai)確定(ding) DNA 或 RNA 結合蛋白

的特(te)(te)異(yi)性。在競爭的特(te)(te)異(yi)和(he)非特(te)(te)異(yi)片段的存在下,依據復合物的特(te)(te)點和(he)強度來(lai)確定特(te)(te)異(yi)結合。

2. 實驗中(zhong)需要用(yong)到(dao)什(shen)么試劑(ji)?

凝膠遷移實驗需要(yao)的結合蛋白(bai),可來源于(yu)chunhua或部(bu)分chunhua的蛋白(bai),或粗的核和胞(bao)質抽提ye。

還(huan)必(bi)須(xu)制備同位素標(biao)記的(de) DNA 或 RNA。一(yi)般,DNA 核苷酸探(tan)針(zhen)用 32P 和 T4 多核苷酸激

酶來作末(mo)端標(biao)記(ji),同位(wei)素標(biao)記(ji)的 RNA 用噬(shi)菌體(ti) RNA 聚合酶和同位(wei)素標(biao)記(ji)的核苷酸在(zai)體(ti)外

合成。Promega 公司的(de) Riboprobe/sup 系統(a,b)可用(yong)于同位素標記的(de) RNA 的(de)體外合

成,DNA 5'末端標記系(xi)統,用于(yu)制備 DNA 探針(zhen),結合反(fan)應所需的(de)組分有:含鹽(yan)的(de)溶ye(氯(lv)

hua鎂,氯hua鈉(na),或(huo)氯hua鉀)、緩沖體系(Tris-HCl 或(huo) HEPES)、還原劑(DTT)、甘(gan)油、

非特(te)異的競爭 DNA(poly(dI:dC)dI:dC),也可能含(han)非離(li)子去(qu)污劑(ji)。在結合蛋白和(he)同位(wei)

素標(biao)記的探針(zhen)作用后,在非變性(xing)的聚丙烯凝膠(jiao)(jiao)電泳上(shang),分離復合物,隨(sui)后將(jiang)凝膠(jiao)(jiao)干燥并放射

自顯(xian)影,或用 PhosphorImage/sup 分(fen)析。3. 凝膠遷移(yi)實驗系統提(ti)供了(le)什么試(shi)劑?

Promega 公司(si)提(ti)供一種凝膠遷移實(shi)驗系(xi)統(tong)檢測(ce) DNA 結(jie)合蛋(dan)白,系(xi)統(tong)可作為(wei)這(zhe)類(lei)實(shi)驗的(de)一

種陽性對照。系統包括目的(de)寡核苷酸,對照 DNA 結(jie)合蛋(dan)白,結(jie)合緩沖ye,用于寡核苷酸探

針末端標記所需的試劑。Core 系統包括(kuo)含重(zhong)組 AP2 蛋白(AP2 抽提ye)的大(da)腸桿(gan)菌抽提

ye和 AP2 的(de)同源(yuan)寡核(he)苷酸。AP2 抽提(ti)ye是從表達 AP2 蛋白的(de)大腸(chang)桿菌(jun)中(zhong)提(ti)取的(de)。另(ling)外,

Core 系統還(huan)含(han) SP1 同源寡核苷酸,凝(ning)膠遷(qian)移結合緩(huan)沖(chong)ye,和能作 20 次對照(zhao)實(shi)驗的 HeLa

核抽(chou)提(ti)ye。Complete 系統含另外 5 個雙鏈寡核苷酸(suan),分別是 AP1、OCT1、CREB、NF-kB、

TFIID 結合位點的同源序列。這些寡(gua)核苷酸可(ke)以在末端(duan)標記(ji)后用作特異(yi)性(xing)探針,或在競爭(zheng)實

驗中用作(zuo)非特異性探針(zhen)。

4. 成功進行凝膠(jiao)遷移實驗,需要優hua哪些(xie)因(yin)素(su)?

凝膠(jiao)遷移實驗在(zai)理論上(shang)很(hen)簡(jian)單也很(hen)快速(su),但(dan)要成功(gong)地進行(xing)凝膠(jiao)遷移實驗,需要優hua一些參數,

這(zhe)主(zhu)要受結(jie)合蛋白的(de)來源和探針結(jie)合位點(dian)特(te)點(dian)的(de)影響。以下是(shi)需要優hua的(de)因素:抽提ye的(de)制

備(核酸酶(mei)和磷酸酶(mei)污染會(hui)使探(tan)針(zhen)降解),結合(he)蛋(dan)白的(de)(de)濃(nong)度(du),探(tan)針(zhen)的(de)(de)濃(nong)度(du),非特異性探(tan)針(zhen)的(de)(de)

濃度,緩沖ye的配(pei)方和(he) pH,聚丙烯凝膠(jiao)電(dian)泳的特點和(he)電(dian)泳條件,保溫時間和(he)溫度,載體(ti)蛋(dan)

白,是否有(you)輔(fu)助因(yin)子(比如(ru)鋅,或鎘等金屬離子,或激素)。總之,反應總體積應zui小(xiao)(20μl)。

為滿足一般要求,結合(he)緩(huan)沖ye含(han) 4%甘油(you),1mM MgCl2,0.5mM EDTA,0.5mM DTT,

50mM NaCl,10mM Tris-HCl(pH7.5), 0.05mg/ml poly dI:dC,或(huo) 10mM HEPES

(pH7.9), 50mM KCl,1mM DTT, 1mM EDTA,10%甘油,0.05mg/ml poly dI:dC

可作為優hua實驗的起(qi)始。

5. 在 DNA 探針的選(xuan)擇上,要(yao)考慮哪些重要(yao)因素?

目的(de) DNA 的(de)長度應小于(yu) 300bp,以有利(li)于(yu)非結合探針和蛋白 DNA 復(fu)合物(wu)的(de)電泳(yong)分離。雙

鏈的(de)(de)合(he)成的(de)(de)寡(gua)核苷(gan)酸和限制性(xing)酶切片段可在凝膠遷移實驗(yan)中用作探(tan)針(zhen)。如目的(de)(de)蛋白已被(bei)鑒(jian)定,則應用短的(de)(de)寡(gua)核苷(gan)酸片段(約為 25bp),這(zhe)樣結(jie)合(he)位(wei)點可和其他因子的(de)(de)結(jie)合(he)位(wei)點區(qu)別(bie)開。

長的限制性酶切片段(duan)可(ke)用于對推定的啟動子(zi)/增強子(zi)區域內(nei)的蛋白結合(he)位點定位。隨后可(ke)用

DNaseI 印跡對蛋白(bai)結合的特(te)異區域(yu)在 DNA 序列水平上作出(chu)分析。

6. 用以下一些轉錄調節因子和 HeLa 細胞核抽(chou)提(ti)物可形成(cheng)哪些復合(he)物:AP1, AP2, CREB,

NFkB, Oct1, Sp1, TFIID, TFIIB。

當(dang)用(yong) HeLa 細胞核抽提物作為(wei)結合(he)蛋(dan)白(bai)的(de)來源時,每 1 個(ge)轉錄調節(jie)因子和它相關(guan)的(de) DNA 同

源序(xu)列結(jie)合形成特征型的結(jie)合形態(tai)。以下的文字描述了每(mei)一個單獨的轉錄調節因子,包括識

別的同(tong)源序列,因子的大小(xiao),特定(ding)的結合(he)條(tiao)件,以及和 HeLa 細胞核抽提物可形成(cheng)的復(fu)合(he)物

的(de)數(shu)目。

 

Contact Us
  • 聯系QQ:185271790
  • 聯系郵箱:cbzzh188188@qq.com
  • 聯系電話:18818844207
  • 聯系地址:廣州市白云區鶴正街1號中海聯8立方創意園A1棟304室

掃一(yi)掃  微信(xin)咨詢

© 2024 廣州市超博科技有(you)限公司 版權所(suo)有(you)  備案(an)號:

技術支持:        GoogleSitemap

服務熱線
020-86438890

微信服務號