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凝膠遷移實驗(EMSA)

更新時間:2019-03-20瀏覽:2632次

凝膠遷移實驗(EMSA)

凝膠遷移或電泳遷移率實驗(EMSA)可以:(1)研究 DNA 結合蛋白和其相關的 DNA 結

合序列相互作用;(2)可用于 DNA 定性和定量分析;(3)用于研究 RNA 結合蛋白和特

定的 RNA 序列的相互作用。

1 實驗方法和原理

凝膠遷移或電泳遷移率實驗(EMSA-electrophoretic mobility shift assay)是一種研究

DNA 結合蛋白和其相關的 DNA 結合序列相互作用的技術,可用于定性和定量分析。這一

技術zui初用于研究 DNA 結合蛋白,目前已用于研究 RNA 結合蛋白和特定的 RNA 序列的

相互作用。

通常將chunhua的蛋白和細胞粗提ye和 32P 同位素標記的 DNA 或 RNA 探針一同保溫,在非變

性的聚丙烯凝膠電泳上,分離復合物和非結合的探針。DNA-復合物或 RNA-復合物比非結

合的探針移動得慢。同位素標記的探針依研究的結合蛋白的不同,可是雙鏈或者是單鏈。當

檢測如轉錄調控因子一類的 DNA 結合蛋白,可用chunhua蛋白,部分chunhua蛋白,或核細胞抽提

ye。在檢測 RNA 結合蛋白時,依據目的 RNA 結合蛋白的位置,可用chunhua或部分chunhua的蛋

白,也可用核或胞質細胞抽提ye。競爭實驗中采用含蛋白結合序列的 DNA 或 RNA的片段和

寡核苷酸片段(特異), 和其它非相關的片段(非特異),來確定 DNA 或 RNA 結合蛋白

的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下,依據復合物的特點和強度來確定特異結合。

2 實驗材料、試劑、儀器耗材

DNA 樣品[γ-32P]ATP、T4 多聚核苷酸激酶、Nuclease-Free Water、T4 多聚核苷酸激酶緩沖ye、

醋酸銨、TE、無水乙醇、TBE buffer、重蒸水、甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、甘油、過硫

酸銨、TEMED(四甲基乙二胺)、EMSA Gel-Shift 結合緩沖ye、溴酚藍等

水浴鍋、PCR 儀、離心機、電泳儀、電泳槽等

3 實驗步驟

一、探針的標記

1. 如下設置探針標記的反應體系:

(1)待標記探針 (1.75 pmol/微升) :2 微升。

(2)T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) :1 微升。

(3)Nuclease-Free Water :5 微升。

(4)[γ-32P]ATP(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml) :1 微升。

(5)T4 Polynucleotide Kinase (5-10 u/微升) :1 微升。

(6)總體積:10 微升

(7)按照上述反應體系依次加入各種試劑,加入同位素后,Vortex 混勻,再加入 T4

Polynucleotide Kinase,混勻。

2. 使用水浴或 PCR 儀,37℃反應 10 分鐘。

3. 加入 1 微升探針標記終止ye,混勻,終止探針標記反應。

4. 再加入 89 微升 TE,混勻。此時可以取少量探針用于檢測標記的效率。通常標記的效率

在 30%以上,即總放射性的 30%以上標 記到了探針上。為實驗簡便起見,通常不必測定

探針的標記效率。5. 標記好的探針立即使用,zui長使用時間一般不宜超過 3 天。標記好的探針可以保存

在-20℃。

二、 探針的chunhua 

通常為實驗簡便起見,可以不必chunhua標記好的探針。在有些時候,chunhua后的探針會改善 EMSA

的電泳結果。如需chunhua,可以按照如 下步驟操作

1. 對于 100 微升標記好的探針,加入 1/4 體積即 25 微升的 5 M 醋酸銨,再加入 2 體積即

200 微升的無水乙醇,混勻。

2. 在-70℃至-80℃沉淀 1 小時,或在-20℃沉淀過夜。

3. 在 4℃,12 000 g-16 000 g 離心 30 分鐘。小心去除上清,切不可觸及沉。

4. 在 4℃,12 000 g-16 000 g 離心 1 分鐘。小心吸去殘余ye體。微晾干沉淀,但不宜過

分干燥。

5. 加入 100 微升 TE,*溶解沉淀。標記好的探針立即使用,zui長使用時間一般不宜

超過 3 天。標記好的探針可以保存在 -20℃。

三、EMSA 膠的配制

1. 準備好倒膠的模具。可以使用常規的灌制蛋白電泳膠的模具,或其它適當的模具。

選擇可以灌制較薄膠的模具,以便于干膠等后續操作。為得到更好的結果,可以選擇可灌制

較大 EMSA 膠的模具。

2. 按照如下配方配制 20 毫升 4%的聚丙烯酰胺凝膠(注意:使用 29:1 等不同比例的 Acr/Bis

對結果影響不大)。

(1)TBE buffer (10X): 1 毫升。

重蒸水:16.2 毫升。

(2)39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v): 2 毫升。(3)80% 甘油: 625 微升。

(4)10% 過硫酸銨 (ammonium persulfate) :150 微升。

(5)TEMED :10 微升

3. 按照上述次序加入各個溶ye,加入 TEMED 前先混勻,加入 TEMED 后立即混勻,并馬

上加入到制膠的模具中。避免產生氣泡, 并加上梳齒。如果發現非常容易形成氣泡,可以

把一塊制膠的玻璃板進行硅烷hua處理。

四、EMSA 結合反應

1. 如下設置 EMSA 結合反應

陰性對照反應:

(1)Nuclease-Free Water :7 微升。

(2)EMSA/Gel-Shift 結合緩沖ye(5X) :2 微升。

(3)細胞核蛋白或chunhua的轉錄因子: 0 微升。

(4)標記好的探針 :1 微升。

(5)總體積 :10 微升。

樣品反應:

(1)Nuclease-Free Water :5 微升。

(2)EMSA/Gel-Shift 結合緩沖ye(5X) :2 微升。

(3)細胞核蛋白或chunhua的轉錄因子 :2 微升。

(4)標記好的探針: 1 微升。

(5)總體積: 10 微升。

探針冷競爭反應:

(1)Nuclease-Free Water :4 微升。(2)EMSA/Gel-Shift 結合緩沖ye(5X) :2 微升。

(3)細胞核蛋白或chunhua的轉錄因子: 2 微升。

(4)未標記的探針: 1 微升。

(5)標記好的探針: 1 微升。

(6)總體積 :10 微升。

突變探針的冷競爭反應:

(1)Nuclease-Free Water :4 微升。

(2)EMSA/Gel-Shift 結合緩沖ye(5X) :2 微升。

(3)細胞核蛋白或chunhua的轉錄因子 :2 微升。

(4)未標記的突變探針: 1 微升。

(5)標記好的探針: 1 微升。

(6)體積 :10 微升

Super-shift 反應:

(1)Nuclease-Free Water:4 微升。

(2)EMSA/Gel-Shift 結合緩沖ye(5X) :2 微升。

(3)細胞核蛋白或chunhua的轉錄因子:2 微升。

(4)目的蛋白特異抗體 :1 微升。

(5)標記好的探針:1 微升。

(6)總體積 :10 微升。

2. 按照上述順序依次加入各種試劑,在加入標記好的探針前先混勻,并且室溫(20-25℃)

放置 10 分鐘,從而消除可能發生的探針和蛋白的非特異性結合,或者讓冷探針優先反應。

然后加入標記好的探針,混勻,室溫(20-25℃)放置 20 分鐘。3. 加入 1 微升 EMSA/Gel-Shift 上樣緩沖ye(無色,10X),混勻后立即上樣。注意:有些時

候溴酚藍會影響蛋白和 DNA 的結合,建 議盡量使用無色的 EMSA/Gel-Shift 上樣緩沖ye。

如果對于使用無色上樣緩沖ye在上樣時感覺到無法上樣,可以在無色上樣緩沖ye里面添加極

少量的藍色的上樣緩沖ye,至能觀察到藍顏色即可。

五、 電泳分析

1. 用 0.5XTBE 作為電泳ye。按照 10V/厘米的電壓預電泳 10 分鐘。預電泳的時候如果有空

余的上樣孔,可以加入少量稀釋好的 1X 的 EMSA 上樣緩沖ye(藍色),以觀察電壓是否正常

進行。

2. 把混合了上樣緩沖ye的樣品加入到上樣孔內。在多余的某個上樣孔內加入 10 微升稀釋好

的 1X 的 EMSA/Gel-Shift 上樣緩沖ye (藍色),用于觀察電泳進行的情況。

3. 按照 10 V/厘米的電壓電泳。確保膠的溫度不超過 30℃,如果溫度升高,需要適當降低

電壓。電泳至 EMSA/Gel-Shift 上樣緩 沖ye中的藍色染料溴酚藍至膠的下緣 1/4 處,停止

電泳。

4. 剪一片大小和 EMSA 膠大小相近或略大的比較厚實的濾紙。小心取下夾有 EMSA 膠的膠

板,用吸水紙或普通草紙大致擦干膠板邊 緣的電壓ye。小心打開兩塊膠板中的上面一塊(注:

通常選擇先移走硅烷hua的那塊玻璃板),把濾紙從EMSA膠的一側逐漸覆蓋住整個EMSA膠,

輕輕把濾紙和膠壓緊。濾紙被膠微微浸濕后(大約不足 1 分鐘),輕輕揭起濾紙,這時 EMSA

膠會被濾紙一起揭起來。把濾紙側向下,放平,在 EMSA 膠的上面覆蓋一層保鮮膜,確保

保鮮膜和膠之間沒有氣泡。

5. 干膠儀器上干燥 EMSA 膠。然后用 X 光片壓片檢測,或用其它適當儀器設備檢測。

4 常見問題分析1. 什么是凝膠遷移或電泳遷移率實驗?

凝膠遷移或電泳遷移率實驗(EMSA)是一種研究 DNA 結合蛋白和其相關的 DNA 結合序

列相互作用的技術,可用于定性和定量分析。這一技術zui初用于研究 DNA 結合蛋白,目前

已用于研究 RNA 結合蛋白和特定的 RNA 序列的相互作用。

通常將chunhua的蛋白和細胞粗提ye和 32P 同位素標記的 DNA 或 RNA 探針一同保溫,在非變

性的聚丙烯凝膠電泳上,分離復合物和非結合的探針。DNA 復合物或 RNA 復合物比非結

合的探針移動得慢。同位素標記的探針依研究的結合蛋白的不同,可是雙鏈或者是單鏈。當

檢測如轉錄調控因子一類的 DNA 結合蛋白,可用chunhua蛋白,部分chunhua蛋白,或核細胞抽提

ye。在檢測 RNA 結合蛋白時,依據目的 RNA 結合蛋白的位置,可用chunhua或部分chunhua的蛋

白,也可用核或胞質細胞抽提ye。競爭實驗中采用含蛋白結合序列的 DNA 或 RNA的片段和

寡核苷酸片段(特異),和其它非相關的片段(非特異),來確定 DNA 或 RNA 結合蛋白

的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下,依據復合物的特點和強度來確定特異結合。

2. 實驗中需要用到什么試劑?

凝膠遷移實驗需要的結合蛋白,可來源于chunhua或部分chunhua的蛋白,或粗的核和胞質抽提ye。

還必須制備同位素標記的 DNA 或 RNA。一般,DNA 核苷酸探針用 32P 和 T4 多核苷酸激

酶來作末端標記,同位素標記的 RNA 用噬菌體 RNA 聚合酶和同位素標記的核苷酸在體外

合成。Promega 公司的 Riboprobe/sup 系統(a,b)可用于同位素標記的 RNA 的體外合

成,DNA 5'末端標記系統,用于制備 DNA 探針,結合反應所需的組分有:含鹽的溶ye(氯

hua鎂,氯hua鈉,或氯hua鉀)、緩沖體系(Tris-HCl 或 HEPES)、還原劑(DTT)、甘油、

非特異的競爭 DNA(poly(dI:dC)dI:dC),也可能含非離子去污劑。在結合蛋白和同位

素標記的探針作用后,在非變性的聚丙烯凝膠電泳上,分離復合物,隨后將凝膠干燥并放射

自顯影,或用 PhosphorImage/sup 分析。3. 凝膠遷移實驗系統提供了什么試劑?

Promega 公司提供一種凝膠遷移實驗系統檢測 DNA 結合蛋白,系統可作為這類實驗的一

種陽性對照。系統包括目的寡核苷酸,對照 DNA 結合蛋白,結合緩沖ye,用于寡核苷酸探

針末端標記所需的試劑。Core 系統包括含重組 AP2 蛋白(AP2 抽提ye)的大腸桿菌抽提

ye和 AP2 的同源寡核苷酸。AP2 抽提ye是從表達 AP2 蛋白的大腸桿菌中提取的。另外,

Core 系統還含 SP1 同源寡核苷酸,凝膠遷移結合緩沖ye,和能作 20 次對照實驗的 HeLa

核抽提ye。Complete 系統含另外 5 個雙鏈寡核苷酸,分別是 AP1、OCT1、CREB、NF-kB、

TFIID 結合位點的同源序列。這些寡核苷酸可以在末端標記后用作特異性探針,或在競爭實

驗中用作非特異性探針。

4. 成功進行凝膠遷移實驗,需要優hua哪些因素?

凝膠遷移實驗在理論上很簡單也很快速,但要成功地進行凝膠遷移實驗,需要優hua一些參數,

這主要受結合蛋白的來源和探針結合位點特點的影響。以下是需要優hua的因素:抽提ye的制

備(核酸酶和磷酸酶污染會使探針降解),結合蛋白的濃度,探針的濃度,非特異性探針的

濃度,緩沖ye的配方和 pH,聚丙烯凝膠電泳的特點和電泳條件,保溫時間和溫度,載體蛋

白,是否有輔助因子(比如鋅,或鎘等金屬離子,或激素)。總之,反應總體積應zui小(20μl)。

為滿足一般要求,結合緩沖ye含 4%甘油,1mM MgCl2,0.5mM EDTA,0.5mM DTT,

50mM NaCl,10mM Tris-HCl(pH7.5), 0.05mg/ml poly dI:dC,或 10mM HEPES

(pH7.9), 50mM KCl,1mM DTT, 1mM EDTA,10%甘油,0.05mg/ml poly dI:dC

可作為優hua實驗的起始。

5. 在 DNA 探針的選擇上,要考慮哪些重要因素?

目的 DNA 的長度應小于 300bp,以有利于非結合探針和蛋白 DNA 復合物的電泳分離。雙

鏈的合成的寡核苷酸和限制性酶切片段可在凝膠遷移實驗中用作探針。如目的蛋白已被鑒定,則應用短的寡核苷酸片段(約為 25bp),這樣結合位點可和其他因子的結合位點區別開。

長的限制性酶切片段可用于對推定的啟動子/增強子區域內的蛋白結合位點定位。隨后可用

DNaseI 印跡對蛋白結合的特異區域在 DNA 序列水平上作出分析。

6. 用以下一些轉錄調節因子和 HeLa 細胞核抽提物可形成哪些復合物:AP1, AP2, CREB,

NFkB, Oct1, Sp1, TFIID, TFIIB。

當用 HeLa 細胞核抽提物作為結合蛋白的來源時,每 1 個轉錄調節因子和它相關的 DNA 同

源序列結合形成特征型的結合形態。以下的文字描述了每一個單獨的轉錄調節因子,包括識

別的同源序列,因子的大小,特定的結合條件,以及和 HeLa 細胞核抽提物可形成的復合物

的數目。

 

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