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DNA 亞硫酸氫鹽修飾和純化操作步驟

更新時間:2019-03-20瀏覽:1929次

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DNA 亞硫酸氫鹽修飾和純化操作步驟

修飾設計:使用 CpGenomeTMkit 使胞嘧啶轉化為尿嘧啶的步驟如下。中等溫度堿性

pH 下使 DNA 變性成為單鏈形式暴露出堿基。試劑一,一種包含亞硫酸氫根的鈉鹽,可使

未甲基化的胞嘧啶磺化和水解脫氨,產生一種尿嘧啶磺酸鹽中間產物。然后 DNA 在另一種

鹽﹙試劑二﹚存在的條件下與一種微粒載體﹙試劑三﹚結合,并通過重復離心和在 70%的

乙醇中重懸浮脫鹽。向尿嘧啶的轉化是通過在 90%的乙醇中反復堿性脫磺酸基作用和脫鹽

完成的。DNA zui終在 TE 緩沖液中通過加熱從載體上洗脫下來。

第1步:試劑準備

(1)3 M NaOH 原料(用前現配)

把 1g 干 NaOH 片劑溶解在 8.3mL 水中。使用此類腐蝕性堿,注意小心謹慎和實驗操

作。

(2)20 mM NaOH/90% EtOH(用前現配)

配制 1mL 該溶液需:900μl 100%的乙醇,93.4μl 水,6.6μl 3M 的氫氧化鈉。

(3)溶解試劑Ⅰ(用前現配

打開前將試劑瓶加溫至室溫。對每份待修飾的樣本,稱取 0.227g DNA 修飾試劑Ⅰ加

入 0.571mL 水中。充分渦旋振蕩混合。使用該試劑時要小心謹慎,因為它對呼吸系統和皮

膚有刺激性。用大約 20μl 3M NaOH 調整 pH 至 5.0,用 pH 試紙檢測 pH 值。試劑Ⅰ避

光保存以免分解。為了*效果,試劑應在配置后立即使用。

(4)溶解試劑Ⅱ

打開前將試劑瓶加溫至室溫。將 1μl β-巰基乙醇加入 20mL 去離子水中。每份待修飾

的 DNA 樣本需將 750μl 該溶液加入到 1.35g DNA 修飾Ⅱ。充分混合確保*溶解。過量

的試劑可用箔紙包裹的容器、2℃-8℃、避光保存長達 6 周。

第二步:DNA 修飾程序

1、在帶有螺旋形瓶蓋的 1.5-2.0mL 的微量離心管中:將 7.0μl 3M NaOH 加入到含有

1.0 μg DNA 的 100μl 水中(10ng/μl),混勻。

注意:如果樣本含有的 DNA 量不到 1.0μg,就向樣本 DNA 中加入 2 μl DNA 修飾試

劑Ⅳ并加水至總體積 100μl。再加入 7.0μl 3M NaOH 并混勻。

2、50℃ DNA 孵育 10 分鐘(加熱塊或水浴)2

3、加入 550 μl 新鮮配制的 DNA 修飾試劑Ⅰ并渦旋振蕩。

4、加熱塊或水浴 50℃避光孵育 4-16 小時。

第三步:初步脫鹽

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強力渦旋振蕩懸浮 DNA 修飾Ⅲ。用 10x 的 1mL 塑料移液管槍頭來回吸排懸液

以分散仍存在的凝塊。

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向含 DNA 溶液的管中加入 5μl 充分懸浮的 DNA 修飾試劑Ⅲ。

3

加入 750μl DNA 修飾試劑Ⅱ并充分混勻。

4

室溫孵育 5-10 分鐘。

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5000 X g 離心 10 秒使 DNA 試劑Ⅲ成顆粒狀。(應出現一種白色的小顆粒。)

棄去上清。

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加入 1.0mL 70%的乙醇,渦旋振蕩,5000 X g 離心 10 秒,棄去上清。該步驟

重復進行,共 3 次。

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將第三次上清棄去后,離心管高速離心 2 分鐘,用塑料移液管槍頭移去剩余上

清。

第四步:完成 DNA 修飾(脫磺酸基作用),再次脫鹽,并洗脫。

1、 適量樣本加入 50μl 20 mM NaOH/90% EtOH 溶液。

2、 充分渦旋振蕩懸浮顆粒,再室溫孵育 5 分鐘。

3、 5000 X g 離心以移除管頂所有成分。加入 1.0mL 90%的乙醇并渦旋振蕩洗脫

顆粒。再旋轉,除去上清。再次重復該步驟。

4、 第二次洗脫除去上清后,高速離心樣本 3 分鐘。

5、 用塑料移液管頭除去所有剩余上清。試管室溫晾干 10-20 分鐘(必須除去酒精

氣味)。

6、 加入 TE 緩沖液。注意:加入 TE 的量取決于起始 DNA 的量和目的用途所需的

加入濃度。例如,如果加入 25μl TE,基于*恢復 1μg DNA 的zui終濃度應為 40ng/μl。

快速強力渦旋振蕩直到顆粒*懸浮。用手輕打或輕敲內容物至管頂(但是不要離心)。

7、 50-60℃下樣本孵育 15 分鐘以洗脫 DNA。

8、 高速離心 2-3 分鐘并用塑料移液管頭轉移樣本(上清)到新管。

9、 進行 MSP 或測序,或-15~-25℃可保存達 2 個月,-80℃可保存 6 個月。避免

重復融化和解凍;可分量儲存。不要將 DNA 存儲在自動除霜冰箱。3

10、 當從一管中轉移已解凍的 DNA 以備用時,避免將試劑Ⅲ轉移到 PCR 反應管中。

通常首先將管充分離心,使殘留的試劑Ⅲ固體成顆粒狀。

三、MSP

(1)引物合成

運用特別設計的針對甲基化和非甲基化序列的引物,引物由上海生物工程有限公司合成。見

表1

表1 甲基化引物序列及擴增條件

hMLH1引物

引物序列(5’~3’)

產物長度

溫度

甲基化(M) 正義

ACGTAGACGTTTTATTAGGGTCGC

115 bp

55℃

甲基化(M) 反義

CCTCATCGTAACTACCCGCG

115 bp

55℃

非甲基化(U) 正義

TTTTGATGTAGATGTTTTATTAGGGTTGT

124 bp

55℃

非甲基化(U) 反義

ACCACCTCATCATAACTACCCACA

124 bp

55℃

(2)PCR反應條件

a 反應體系:10×PCR 緩沖液 5μl,2.5mmol/LdNTP4μl,甲基化上下游引物和去甲

基化上下游引物分別為 1μl,甲基化模板 DNA5μl,Taq 酶 0.25μl,加水至總體積 50μl。

b 循環條件:

程序

溫度

時間

預變性

95℃

60 sec

變性

95℃

30 sec

退火

55℃

30 sec

終末延伸

72℃

60 sec

共 35 個循環

(3)PCR 產物結果判定:瓊脂糖凝膠電泳

a 甲基化陽性:甲基化特異性引物擴增出相應長度的片斷,但非甲基化特異性引物未

擴增出相應長度的片斷,則判斷基因啟動子區 5’CpG 島甲基化陽性。4

b 甲基化陰性:非甲基化特異性引物擴增出相應長度的片斷,但甲基化特異性引物未

擴增出相應長度的片斷。則判斷基因啟動子區 5’CpG 島甲基化陰性。

 

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