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DNA 亞硫酸氫鹽修飾和純化操作步驟

更(geng)新時(shi)間:2019-03-20瀏覽:1965次

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DNA 亞硫(liu)酸氫鹽修飾和純化操(cao)作步(bu)驟

修(xiu)飾設計:使用 CpGenomeTMkit 使胞嘧(mi)(mi)啶(ding)轉(zhuan)化為尿嘧(mi)(mi)啶(ding)的(de)步驟如下(xia)。中等溫度堿性

pH 下使 DNA 變性成為(wei)單鏈形式(shi)暴露(lu)出堿基。試劑一(yi),一(yi)種(zhong)包含亞硫酸(suan)氫根的鈉鹽,可(ke)使

未(wei)甲(jia)基化的胞嘧啶磺化和(he)水(shui)解(jie)脫(tuo)氨,產生一(yi)種(zhong)尿嘧啶磺酸鹽中間(jian)產物。然后 DNA 在另一(yi)種(zhong)

鹽(yan)﹙試(shi)劑二﹚存在的條件下與一種(zhong)微粒載(zai)體(ti)﹙試(shi)劑三﹚結合,并(bing)通過重復離心和(he)在 70%的

乙醇中重懸浮脫(tuo)鹽。向尿嘧啶(ding)的轉化是(shi)通過在(zai) 90%的乙醇中反復堿性脫(tuo)磺酸基作(zuo)用(yong)和脫(tuo)鹽

完成的。DNA zui終在(zai) TE 緩沖液中通過(guo)加(jia)熱從(cong)載體上洗脫下(xia)來。

第1步:試(shi)劑(ji)準備

(1)3 M NaOH 原料(用前(qian)現(xian)配)

把 1g 干 NaOH 片劑溶解(jie)在 8.3mL 水中。使用此類腐蝕性(xing)堿(jian),注意(yi)小心(xin)謹慎和實驗操

作。

(2)20 mM NaOH/90% EtOH(用(yong)前(qian)現配)

配(pei)制(zhi) 1mL 該(gai)溶(rong)液需(xu):900μl 100%的乙醇(chun),93.4μl 水(shui),6.6μl 3M 的氫(qing)氧化鈉。

(3)溶解(jie)試劑Ⅰ(用前現配

打開(kai)前(qian)將試劑(ji)瓶加(jia)溫至室溫。對(dui)每份待修(xiu)飾的樣(yang)本,稱取 0.227g DNA 修(xiu)飾試劑(ji)Ⅰ加(jia)

入 0.571mL 水中。充分渦(wo)旋振蕩混合(he)。使用(yong)該(gai)試劑時要小心謹慎,因為它(ta)對呼吸系統和皮

膚有刺激性。用大約 20μl 3M NaOH 調整 pH 至 5.0,用 pH 試(shi)紙(zhi)檢(jian)測(ce) pH 值(zhi)。試(shi)劑Ⅰ避

光(guang)保存以免分解(jie)。為了*效果,試(shi)劑應在配置后立即使用。

(4)溶(rong)解試劑(ji)Ⅱ

打開前將試劑瓶加溫至室溫。將 1μl β-巰基乙醇加入 20mL 去離子水中。每份待修飾

的 DNA 樣本需將 750μl 該溶(rong)(rong)液加入到 1.35g DNA 修飾(shi)Ⅱ。充分混(hun)合確保*溶(rong)(rong)解。過(guo)量

的(de)(de)試(shi)劑可用箔紙包裹(guo)的(de)(de)容器、2℃-8℃、避光保存長達 6 周。

第二(er)步:DNA 修飾程(cheng)序

1、在(zai)帶有螺旋形瓶蓋的(de) 1.5-2.0mL 的(de)微量離心(xin)管中:將 7.0μl 3M NaOH 加入(ru)到含有

1.0 μg DNA 的 100μl 水中(10ng/μl),混勻(yun)。

注意:如果(guo)樣本(ben)含有的 DNA 量不到 1.0μg,就向(xiang)樣本(ben) DNA 中(zhong)加入 2 μl DNA 修(xiu)飾試

劑Ⅳ并加水至(zhi)總體積 100μl。再加入 7.0μl 3M NaOH 并混(hun)勻。

2、50℃ DNA 孵育 10 分鐘(zhong)(加熱塊(kuai)或水浴(yu))2

3、加入 550 μl 新鮮(xian)配制的 DNA 修飾試(shi)劑(ji)Ⅰ并渦(wo)旋振蕩。

4、加熱塊或水浴 50℃避光孵(fu)育 4-16 小時。

第三步(bu):初步(bu)脫鹽

1

強(qiang)力渦(wo)旋振蕩懸浮 DNA 修飾Ⅲ。用 10x 的 1mL 塑料移液管槍頭來回(hui)吸排懸液

以分散仍(reng)存(cun)在的凝塊(kuai)。

2

向含 DNA 溶液的(de)管中加入 5μl 充分懸(xuan)浮的(de) DNA 修飾試(shi)劑Ⅲ。

3

加入 750μl DNA 修飾(shi)試劑Ⅱ并充(chong)分混勻(yun)。

4

室溫孵育 5-10 分鐘(zhong)。

5

5000 X g 離心 10 秒使 DNA 試劑Ⅲ成顆粒狀。(應出現一種白色(se)的小顆粒。)

棄去(qu)上清。

6

加入 1.0mL 70%的(de)乙醇,渦旋振蕩,5000 X g 離(li)心 10 秒(miao),棄去(qu)上清(qing)。該(gai)步驟

重復進行(xing),共 3 次(ci)。

7

將第三次上清棄去后,離(li)心管高速離(li)心 2 分鐘,用塑(su)料移(yi)液管槍頭移(yi)去剩余上

清。

第(di)四步:完成 DNA 修飾(脫(tuo)磺酸基(ji)作用),再次脫(tuo)鹽,并(bing)洗脫(tuo)。

1、 適(shi)量樣(yang)本加入 50μl 20 mM NaOH/90% EtOH 溶液(ye)。

2、 充分渦旋振蕩懸浮(fu)顆(ke)粒,再室溫孵育 5 分鐘。

3、 5000 X g 離心(xin)以移除管頂所有成分。加入 1.0mL 90%的乙醇并(bing)渦(wo)旋振蕩洗脫

顆粒。再旋(xuan)轉,除去上(shang)清。再次重復該步驟。

4、 第二次洗脫除去上清后,高(gao)速離心樣(yang)本(ben) 3 分鐘。

5、 用(yong)塑料移液管(guan)(guan)頭除去(qu)所有剩余上清。試管(guan)(guan)室溫晾干 10-20 分(fen)鐘(必須(xu)除去(qu)酒(jiu)精

氣味(wei))。

6、 加(jia)入(ru) TE 緩沖液。注意:加(jia)入(ru) TE 的量取決于起始 DNA 的量和目的用(yong)途所需的

加(jia)入濃度。例如(ru)(ru),如(ru)(ru)果加(jia)入 25μl TE,基于*恢復 1μg DNA 的(de)zui終(zhong)濃度應為 40ng/μl。

快速強力渦旋振蕩直到顆(ke)粒*懸浮。用手輕打或輕敲內容物至管頂(但是不要離心)。

7、 50-60℃下樣本孵育(yu) 15 分鐘(zhong)以洗脫 DNA。

8、 高速離心 2-3 分鐘并(bing)用塑料(liao)移(yi)液管頭轉移(yi)樣本(上清)到(dao)新管。

9、 進行(xing) MSP 或(huo)測(ce)序,或(huo)-15~-25℃可保(bao)存達 2 個月(yue),-80℃可保(bao)存 6 個月(yue)。避免(mian)

重復融化和解凍(dong);可分量儲存(cun)。不要將 DNA 存(cun)儲在自(zi)動除(chu)霜冰箱。3

10、 當從一管中(zhong)轉移已解(jie)凍的 DNA 以備用時,避免將試(shi)劑(ji)Ⅲ轉移到 PCR 反(fan)應管中(zhong)。

通(tong)常首(shou)先將(jiang)管充分離心(xin),使殘留的試劑Ⅲ固體成顆(ke)粒狀。

三、MSP

(1)引物(wu)合成

運(yun)用(yong)特(te)別設計(ji)的(de)針對甲(jia)基化(hua)和(he)非(fei)甲(jia)基化(hua)序列的(de)引物(wu),引物(wu)由(you)上海生物(wu)工程有限公司(si)合成。見

表1

表1 甲基化引物序列(lie)及擴(kuo)增條件

hMLH1引物

引物序列(5’~3’)

產物長度

溫(wen)度(du)

甲基化(M) 正義

ACGTAGACGTTTTATTAGGGTCGC

115 bp

55℃

甲基化(M) 反義

CCTCATCGTAACTACCCGCG

115 bp

55℃

非甲(jia)基化(hua)(U) 正義

TTTTGATGTAGATGTTTTATTAGGGTTGT

124 bp

55℃

非甲基(ji)化(U) 反義(yi)

ACCACCTCATCATAACTACCCACA

124 bp

55℃

(2)PCR反應(ying)條件

a 反(fan)應(ying)體系:10×PCR 緩沖液 5μl,2.5mmol/LdNTP4μl,甲(jia)(jia)基化(hua)上(shang)下游引物和去甲(jia)(jia)

基(ji)(ji)化(hua)上(shang)下(xia)游引物分別為(wei) 1μl,甲基(ji)(ji)化(hua)模板 DNA5μl,Taq 酶 0.25μl,加水至總體積(ji) 50μl。

b 循環條件(jian):

程序(xu)

溫(wen)度

時間(jian)

預變性(xing)

95℃

60 sec

變性

95℃

30 sec

退火

55℃

30 sec

終末延伸(shen)

72℃

60 sec

共 35 個(ge)循環

(3)PCR 產(chan)物結(jie)果判定:瓊脂糖凝膠(jiao)電泳

a 甲基化陽性(xing):甲基化特(te)異性(xing)引(yin)物(wu)擴增出相應長度(du)的片斷,但非甲基化特(te)異性(xing)引(yin)物(wu)未

擴增出相應長度的片斷,則判(pan)斷基因啟動子區 5’CpG 島甲基化陽性。4

b 甲(jia)基化(hua)陰性(xing):非(fei)甲(jia)基化(hua)特異(yi)性(xing)引物擴增(zeng)出相(xiang)應長度的片斷,但甲(jia)基化(hua)特異(yi)性(xing)引物未

擴增出(chu)相應長度的(de)片斷。則判(pan)斷基因啟動子區 5’CpG 島甲基化陰性。

 

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