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雙向電泳操作步驟及相關試劑配制

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雙向電泳操作步驟及相關試劑(ji)配制

A. 實驗過程

一、實(shi)驗(yan)原(yuan)理:

2-DE 的第1向(xiang)電(dian)泳等電(dian)聚(ju)焦是(shi)(shi)基于(yu)等電(dian)點不(bu)同(tong)而將(jiang)蛋白粗步分離,第二向(xiang) SDS-PAGE 是(shi)(shi)基

于蛋(dan)白質分(fen)子量不同,而將一(yi)向分(fen)離后(hou)的蛋(dan)白進一(yi)步分(fen)離。這(zhe)樣就(jiu)可以(yi)得到蛋(dan)白質等電(dian)點和

分子量的信息。

二(er)、實驗(yan)步驟:

1.樣品的溶解(jie)

取純(chun)化(hua)后的晶體蛋白(bai)(bai) 3.0mg,加入 300μl 裂(lie)解液(ye)(1mg 蛋白(bai)(bai):100μl 裂(lie)解液(ye))振蕩器上(shang)振蕩

10min左(zuo)右(you),共處理一個小時。其中每隔10~15分(fen)鐘振(zhen)蕩一次,然后(hou)13200rpm離心15min

除(chu)雜質,取上清分裝(zhuang),每管 70μl,—80℃保存(cun)。

2.Bradford 法(fa)測蛋白含量(liang)

取 0.001g BSA(牛血清白蛋白)用 1ml 超純(chun)水溶解,測(ce)定 BSA 標(biao)準曲線及樣(yang)品(pin)蛋白含量。

取 7 個 10ml 的(de)離心管,首先在 5 個離心管中按次(ci)序加入 0μl,5μl,10μl,15μl,20μl 的(de) BSA

溶(rong)解液,另 2 管中(zhong)分別加入(ru) 2μl 的待測樣品溶(rong)液,再(zai)在每(mei)管中(zhong)加入(ru)相應體(ti)積的雙蒸水(shui)(總

體積為(wei) 80μl),然后,各管中(zhong)分別加入 4ml 的(de)(de) Bradford 液(原來配好的(de)(de) Bradford 液使用

前需再取(qu)需要的劑量過(guo)濾一遍方能使用),搖勻,2min 在(zai) 595nm 下(xia),按由低(di)到高的濃度順

序測定各濃度 BSA 的(de) OD 值,再測樣品 OD 值。(測量過程要在(zai)一個小(xiao)時內完成)。例如:

編號

蛋(dan)白量(ul)

Buffer(ul)Bradford(ml)

OD595 值

1

0

4

0

2

5

4

0.024

3

10

4

0.0614

15

4

0.091

5

20

4

0.116

Bt4

2 78 4 0.079

Bt4

4 76 4

轉 Bt4 2 78 4 0.075

轉 Bt4 4 76

4

標準曲(qu)線方(fang)程式:Y= aX+b.其中(zhong) Y 為(wei) OD 值,X 為(wei)蛋白含量。a、b 通過作圖(tu)輸(shu)入(ru)數據(ju)可

相關系數通(tong)過輸入數據,作圖,軟件分析可得

OD 值測(ce)量過程:

比色皿用(yong) 70%的乙(yi)醇保存,待用(yong)時用(yong)雙蒸水沖洗,再(zai)用(yong)無水乙(yi)醇沖洗,雙蒸水沖洗,再(zai)加

入待(dai)測樣(yang)品溶液潤洗,然(ran)后,加入樣(yang)品,測定(ding) OD 值(zhi)。

3.雙向(xiang)電(dian)泳第(di)1向(xiang)---IEF(雙向(xiang)電(dian)泳中一(yi)律使(shi)用超純(chun)水)

3.1 水化液的制備(bei)

稱取 2.0mg 的(de) DTT,用(yong) 700μl 水化液儲液溶解后,加入 8μl 0.05% 的(de)溴酚蘭,3.5μl

(0.5%v/v)IPG buffer (pH 3-10)振蕩混勻,13200rpm 離(li)心 15min 除雜質(zhi),取上清。

在含 300μg 蛋(dan)白(經(jing)驗值(zhi))的樣品溶解液中加入水(shui)化液,至終體積為(wei) 340μl,振蕩器上(shang)振

蕩混(hun)合,13200rpm 離心 15min 除(chu)雜質,取上(shang)清(qing)。

3.2 點樣(yang),上膠

分(fen)兩(liang)次吸取樣(yang)(yang)品(pin),每次 170μl,按從正極(ji)(ji)到負極(ji)(ji)的(de)順序加入點樣(yang)(yang)槽兩(liang)側,再(zai)用鑷(nie)子撥開(kai)Immobiline DryStrip gels (18cm,pH 3—10)膠(jiao)條,從正極(ji)(ji)到負極(ji)(ji)將膠(jiao)條壓入槽中,膠(jiao)面(mian)

接觸(chu)加(jia)入的樣(yang)品。注意(yi):膠條使(shi)用前,要(yao)在(zai)室溫中平衡 30 分(fen)鐘(zhong);加(jia)樣(yang)時,正極要(yao)多加(jia)樣(yang),

以防氣泡(pao)的(de)產生(sheng);壓膠時不能產生(sheng)氣泡(pao);酸性端(duan)(duan)對應正極,堿(jian)性端(duan)(duan)對應負極;樣品(pin)加(jia)好(hao)后,

加同樣(yang)多(duo)的覆蓋油(Bio-Rad),兩個上樣(yang)槽(cao)必須與底線(xian)齊(qi)平。

3.3 IPG 聚焦系統跑膠(jiao)程(cheng)序(xu)的(de)設定(跑膠(jiao)溫度為 20℃)

S1 (30v,12hr,360vhs,step)

S2 (500v,1hr,500vhs,step)

S3 (1000v,1hr,1000vhs,step)

S4 (8000v,0.5hr,2250vhs,Grad)

S5 (8000v,5hr,40000vhs,step)共計 44110vhs,19.5 小時(shi)

其(qi)中 S1 用于泡脹水化膠(jiao)條,S2 和(he) S3 用于去小離子,S4 和(he) S5 用于聚焦。

3.4 平衡

用鑷(nie)子夾出(chu)膠條,超純水沖洗后,在濾紙上(shang)吸(xi)干(膠面(mian),即接觸樣品那一面(mian)不能(neng)接觸濾紙,

如(ru)果為 18cm 的膠條要(yao)將兩頭剪去),再以超純水沖洗(xi)(xi),濾紙吸干(gan)(再次沖洗(xi)(xi)過程也可省略),

然(ran)后(hou)用鑷子夾(jia)住膠(jiao)條以正(即酸(suan)性端)向(xiang)下(xia)負(即堿性端(duan))向上,放入用(yong)來平衡

的試管(guan)中(鑷(nie)子所夾的是堿(jian)性端,酸性端留有(you)溴(xiu)酚蘭作為標記),用平(ping)衡液(ye) A,平(ping)衡液(ye) B 先

后(hou)平衡 15min。注:平衡時(shi)要注意(yi)保持(chi)膠面始終向上(shang),不能接觸(chu)平衡管壁。

平衡第(di)二次時,在沸水中(zhong)煮 Marker 3min,剪兩個同樣大(da)小的小紙片,長度與一向(xiang)膠條的寬

度等同,然后吸取煮好的(de) Marker,轉入 SDS—PAGE 膠(jiao)面(mian)上,保持緊密(mi)貼合;同樣在第二(er)

次平衡時,煮 5%的瓊(qiong)脂糖 10ml。

4.雙(shuang)向電(dian)泳第(di)二向---SDS-PAGE

4.1 配膠(兩根(gen)膠條所用(yong)劑(ji)量(liang))分離膠:(T=8% 80 ml):溶液于(yu)真空機中抽氣后再加 APS 和 TEMED

30 % 丙烯酰胺儲液 21.28ml

分離膠 buffer 20ml 10%APS 220μl TEMED 44μl

雙蒸水 38.72ml

濃縮膠:(T=4.8% 10ml)

30 % 丙烯酰胺儲液 1.6ml

濃縮(suo)膠 buffer 2.5ml 10%APS 30μl TEMED 5μl

雙(shuang)蒸水(shui) 5.9ml

4.2 灌(guan)膠

將玻(bo)璃(li)板(ban)洗凈后,室(shi)溫晾干,然后,將電泳槽(cao)平衡好(hao),玻(bo)璃(li)板(ban)夾好(hao),再在玻(bo)璃(li)板(ban)底部涂(tu)上凡士(shi)林以

防漏膠,倒(dao)入正丁醇(chun)壓膠,凝(ning)膠后(這(zhe)時會出現三(san)條線(xian)),用注(zhu)射器吸去正丁醇(chun),超純水洗兩次,再

用(yong)濾紙除水后(hou),倒(dao)入濃縮膠,正丁醇(chun)壓膠,凝(ning)膠后(hou),用(yong)注射器吸去正丁醇(chun),超純水洗兩次,再加入超

純水(shui),用保險膜封好。

4.3 轉移

剪兩個小(xiao)的濾紙片(pian),吸取 Marker 后,放入 SDS—PAGE 膠面的一端(duan)。然后,將平衡好的 IPG

膠(jiao)條貼靠在(zai)(zai)玻璃板上,加少量的 5%的瓊脂糖溶液在(zai)(zai)膠(jiao)面上(瓊脂糖凝膠(jiao)在(zai)(zai)轉移*幾分(fen)鐘(zhong)的

時(shi)候配(pei)好(hao),水(shui)浴(yu)加熱溶(rong)解(jie),并保持燒杯中(zhong)水(shui)處于沸騰(teng)狀(zhuang)態,至用之(zhi)前再(zai)拿出來),再(zai)將 IPG 膠條緩(huan)

緩加入 SDS—PAGE 膠面(mian),其中不斷補加 5%的瓊脂糖溶液(ye),注意不能產生氣泡。

4.4 跑(pao)膠濃縮(suo)膠 13mA 分離膠 20mA 共約 5.5 個小(xiao)時

5.銀(yin)染(ran)(ran)(兩根(gen)膠(jiao)條所用(yong)劑量(liang))(銀(yin)染(ran)(ran)特別注意(yi)用(yong)超(chao)純水(shui))

5.1 固定(ding) 30min 無(wu)水乙醇 200ml+乙酸(suan) 50ml,用超純水定(ding)容至 500ml

5.2 敏化 30min 無水乙(yi)醇 150ml

Na2S2O3S226;5H2O 1.5688g

無水乙(yi)酸鈉 34g

先(xian)用水溶解 Na2S2O3S226;5H2O 和乙酸(suan)鈉,再(zai)加乙醇,后定容至 500ml

5.3 洗(xi)滌(di) 5min × 3 次

5.4 銀染 20min AgNO3 1.25g 用超純(chun)水定容(rong)至 500ml

5.5 洗滌 1min × 2 次

5.6 顯影 無(wu)水(shui) Na2CO3 12.5g 用超純水(shui)定容至 500ml

甲醛(37%)0.1ml,臨時加(jia)

5.7 終止 10min EDTA—Na2S226;2H2O 7.3g 用超純水定容至(zhi) 500ml

5.8 洗(xi)滌 5min × 3 次(ci)

注:整個雙向電(dian)泳實驗(yan)中全(quan)部使用超純水,盡量減少離(li)子的影(ying)響(xiang)。

B. 實驗相關試劑配制1. Bradford 工作液

95%乙(yi)醇 25ml 先用乙(yi)醇溶(rong)解(jie)考馬(ma)斯亮蘭 G250,溶(rong)解(jie)完后再加磷

85%磷酸 52ml 酸,后超純水定容至 500ml。過濾后置于棕色瓶(ping)

考(kao)馬斯亮蘭(lan) G250 0.035g 外加油皮紙保(bao)存(Bradford 不穩定,一周內有(you)效)

2. 裂解(jie)液

尿素 8M

硫(liu)脲 2M

CHAPS 4%

DTT 60 mM

Tris—base 40 mM(如果(guo)有(you)條件可以添加 PMSF 0.5mM 和(he) 5%的 Pharmalate)

3.水(shui)化液儲液

尿素 8M

硫脲 2M

CHAPS 4%

Tris—base 40 mM

4.分(fen)離膠(jiao) buffer (pH8.8) 250ml

SDS 0.4% 1g

Tris—HCl 1.5M 45.4275g5.濃縮膠 buffer (pH6.8) 100ml

SDS 0.4% 0.4g

Tris—HCl 0.5M 6.07g

6.凝膠儲存液(ye)(30%的丙烯酰(xian)胺)250ml

Acr 29.2% 73g

Bis 0.8% 2g

7.電極緩(huan)沖液(跑一(yi)次要(yao)配(pei)制 2500ml)

甘氨酸(suan) 43.2g 36g

Tris 9g 或 7.5g

SDS 3g 2.5g

超純(chun)水定容至 3000ml 超純(chun)水定容至 2500ml

8. 0.5M Tris —HCl pH 6.8 儲液(ye)

6.1g Tris 先(xian)用 30ml 超純(chun)水溶解,再用 46ml,3M HCl 調 pH6.8,再加水定容至(zhi) 100ml

9. 平衡液儲液

脲(即尿素)36g

甘油 30% 30ml

SDS 1% 1g

0.5M Tris—HCl pH6.8 10ml 超(chao)純水定容至(zhi) 100ml

10.平衡液 A(一根膠條)

DTT 20mg

平(ping)衡液儲液 10ml

11.平衡液 B(一根膠條)碘(dian)乙酰氨 300mg

平衡(heng)液儲液 10ml

0.05%溴(xiu)酚蘭(lan) 15μl (平衡(heng)液 A、B 均(jun)需臨(lin)時配(pei)制)

12.0.5%瓊脂糖 10ml

瓊脂(zhi)糖(tang) 0.05g

電極緩沖液 10ml

溴酚蘭 25μl

補:4、5、6 的(de)溶液需過濾后儲(chu)存于 4C 備用。

C. 藥品

CHAPS 兼(jian)性(xing)離子(zi)去垢(gou)劑 去垢(gou)劑可破壞蛋白質分子(zi)之(zhi)間的疏(shu)水(shui)相互作用,

SDS 離子型去垢劑 提(ti)高蛋白質的溶解(jie)性,防止在等電聚焦時析(xi)出

尿素 離液劑 可改變(bian)或破壞氫鍵等次(ci)級(ji)鍵的結構,使蛋白質

硫脲 離液(ye)劑 變性并使蛋白失活(huo)。尿素和(he)硫脲聯合(he)使用,可

以大大增加蛋(dan)白質的溶解性

DTT 還原劑 斷裂蛋白(bai)(bai)質分(fen)子(zi)中 Cys 殘基(ji)之(zhi)間形(xing)成的二硫鍵,增加蛋白(bai)(bai)質的溶解性。但過分(fen)

提高 DTT 的濃(nong)度,由于它 pKa 在 8 左右,因而會影響 pH 梯度。DTT 在堿(jian)性 pH 下(xia)會去質

子化,等電聚焦時會損耗(hao),導致二硫鍵復(fu)原,蛋白(bai)質(zhi)沉淀BSA Bradford 中(zhong)制作(zuo)標準(zhun)曲線用

無(wu)水乙(yi)醇 和磷酸一起(qi),提供(gong) Bradford 中的環境

磷酸(suan) 提供 Bradford 中的酸(suan)性環(huan)境(jing)

Tris 構成緩沖液的(de)成分,可用于抗衡 pH 的(de)變化

IPG buffer

覆(fu)蓋(gai)液(ye) 即礦物(wu)油,防止水分蒸發,樣(yang)品干燥。

丙(bing)(bing)烯酰胺(Acr) 以(yi)丙(bing)(bing)烯酰胺為單體,甲叉(cha)二丙(bing)(bing)烯酰胺為交聯劑,

甲叉二丙烯酰胺 (Bis)在催化劑(Aps)和引(yin)發劑(TEMED)作用下,聚合交聯成三維

網(wang)狀(zhuang)結(jie)構

瓊脂糖(tang)

溴酚(fen)蘭 指示劑作用

碘乙酰氨(an)(IAA)平衡液 B 中(zhong)使用,中(zhong)和 A 液中(zhong)的(de) DTT

正丁醇(chun) 比(bi)聚丙烯酰(xian)胺密度小,用于凝膠制作過程中(zhong)的壓(ya)膠

甘油 無機鹽的良(liang)好溶劑,熱穩定性(xing)好

Marker

考(kao)(kao)馬斯(si)亮蘭 G250(Bradford 法用)考(kao)(kao)馬斯(si)亮蘭 G250 有(you)紅(hong)、藍兩種不同(tong)顏色的形式(shi)在(zai)一(yi)

定濃度的(de)乙醇及酸性條件下,可配成(cheng)淡紅色(se)的(de)溶液,當與(yu)蛋(dan)白結合后,產生藍(lan)色(se)化合物,反

應(ying)迅速而穩(wen)定,反應(ying)化合(he)物在 465~595nm 處有大的光吸(xi)收值(zhi),化合(he)物顏色 深淺(qian)與蛋(dan)白

濃度的高低成正比關系,因此(ci)可檢測(ce) 595nm 的光吸收值的大小(xiao)計算蛋白的含量

甘氨(an)酸 與 Tris 構成緩沖系(xi)統AgNO3

EDTA 金屬螯合劑,可(ke)以結合銀離子,終止銀染過程。

 

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