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雙向電泳操作步驟及相關試劑配制

更新時間:2019-03-19瀏覽:2435次

雙向電泳操作步驟及相關試劑配制

A. 實驗過程

一、實驗原理:

2-DE 的第1向電泳等電聚焦是基于等電點不同而將蛋白粗步分離,第二向 SDS-PAGE 是基

于蛋白質分子量不同,而將一向分離后的蛋白進一步分離。這樣就可以得到蛋白質等電點和

分子量的信息。

二、實驗步驟:

1.樣品的溶解

取純化后的晶體蛋白 3.0mg,加入 300μl 裂解液(1mg 蛋白:100μl 裂解液)振蕩器上振蕩

10min左右,共處理一個小時。其中每隔10~15分鐘振蕩一次,然后13200rpm離心15min

除雜質,取上清分裝,每管 70μl,—80℃保存。

2.Bradford 法測蛋白含量

取 0.001g BSA(牛血清白蛋白)用 1ml 超純水溶解,測定 BSA 標準曲線及樣品蛋白含量。

取 7 個 10ml 的離心管,首先在 5 個離心管中按次序加入 0μl,5μl,10μl,15μl,20μl 的 BSA

溶解液,另 2 管中分別加入 2μl 的待測樣品溶液,再在每管中加入相應體積的雙蒸水(總

體積為 80μl),然后,各管中分別加入 4ml 的 Bradford 液(原來配好的 Bradford 液使用

前需再取需要的劑量過濾一遍方能使用),搖勻,2min 在 595nm 下,按由低到高的濃度順

序測定各濃度 BSA 的 OD 值,再測樣品 OD 值。(測量過程要在一個小時內完成)。例如:

編號

蛋白量(ul)

Buffer(ul)Bradford(ml)

OD595 值

1

0

4

0

2

5

4

0.024

3

10

4

0.0614

15

4

0.091

5

20

4

0.116

Bt4

2 78 4 0.079

Bt4

4 76 4

轉 Bt4 2 78 4 0.075

轉 Bt4 4 76

4

標準曲線方程式:Y= aX+b.其中 Y 為 OD 值,X 為蛋白含量。a、b 通過作圖輸入數據可

相關系數通過輸入數據,作圖,軟件分析可得

OD 值測量過程:

比色皿用 70%的乙醇保存,待用時用雙蒸水沖洗,再用無水乙醇沖洗,雙蒸水沖洗,再加

入待測樣品溶液潤洗,然后,加入樣品,測定 OD 值。

3.雙向電泳第1向---IEF(雙向電泳中一律使用超純水)

3.1 水化液的制備

稱取 2.0mg 的 DTT,用 700μl 水化液儲液溶解后,加入 8μl 0.05% 的溴酚蘭,3.5μl

(0.5%v/v)IPG buffer (pH 3-10)振蕩混勻,13200rpm 離心 15min 除雜質,取上清。

在含 300μg 蛋白(經驗值)的樣品溶解液中加入水化液,至終體積為 340μl,振蕩器上振

蕩混合,13200rpm 離心 15min 除雜質,取上清。

3.2 點樣,上膠

分兩次吸取樣品,每次 170μl,按從正極到負極的順序加入點樣槽兩側,再用鑷子撥開Immobiline DryStrip gels (18cm,pH 3—10)膠條,從正極到負極將膠條壓入槽中,膠面

接觸加入的樣品。注意:膠條使用前,要在室溫中平衡 30 分鐘;加樣時,正極要多加樣,

以防氣泡的產生;壓膠時不能產生氣泡;酸性端對應正極,堿性端對應負極;樣品加好后,

加同樣多的覆蓋油(Bio-Rad),兩個上樣槽必須與底線齊平。

3.3 IPG 聚焦系統跑膠程序的設定(跑膠溫度為 20℃)

S1 (30v,12hr,360vhs,step)

S2 (500v,1hr,500vhs,step)

S3 (1000v,1hr,1000vhs,step)

S4 (8000v,0.5hr,2250vhs,Grad)

S5 (8000v,5hr,40000vhs,step)共計 44110vhs,19.5 小時

其中 S1 用于泡脹水化膠條,S2 和 S3 用于去小離子,S4 和 S5 用于聚焦。

3.4 平衡

用鑷子夾出膠條,超純水沖洗后,在濾紙上吸干(膠面,即接觸樣品那一面不能接觸濾紙,

如果為 18cm 的膠條要將兩頭剪去),再以超純水沖洗,濾紙吸干(再次沖洗過程也可省略),

然后用鑷子夾住膠條以正(即酸性端)向下負(即堿性端)向上,放入用來平衡

的試管中(鑷子所夾的是堿性端,酸性端留有溴酚蘭作為標記),用平衡液 A,平衡液 B 先

后平衡 15min。注:平衡時要注意保持膠面始終向上,不能接觸平衡管壁。

平衡第二次時,在沸水中煮 Marker 3min,剪兩個同樣大小的小紙片,長度與一向膠條的寬

度等同,然后吸取煮好的 Marker,轉入 SDS—PAGE 膠面上,保持緊密貼合;同樣在第二

次平衡時,煮 5%的瓊脂糖 10ml。

4.雙向電泳第二向---SDS-PAGE

4.1 配膠(兩根膠條所用劑量)分離膠:(T=8% 80 ml):溶液于真空機中抽氣后再加 APS 和 TEMED

30 % 丙烯酰胺儲液 21.28ml

分離膠 buffer 20ml 10%APS 220μl TEMED 44μl

雙蒸水 38.72ml

濃縮膠:(T=4.8% 10ml)

30 % 丙烯酰胺儲液 1.6ml

濃縮膠 buffer 2.5ml 10%APS 30μl TEMED 5μl

雙蒸水 5.9ml

4.2 灌膠

將玻璃板洗凈后,室溫晾干,然后,將電泳槽平衡好,玻璃板夾好,再在玻璃板底部涂上凡士林以

防漏膠,倒入正丁醇壓膠,凝膠后(這時會出現三條線),用注射器吸去正丁醇,超純水洗兩次,再

用濾紙除水后,倒入濃縮膠,正丁醇壓膠,凝膠后,用注射器吸去正丁醇,超純水洗兩次,再加入超

純水,用保險膜封好。

4.3 轉移

剪兩個小的濾紙片,吸取 Marker 后,放入 SDS—PAGE 膠面的一端。然后,將平衡好的 IPG

膠條貼靠在玻璃板上,加少量的 5%的瓊脂糖溶液在膠面上(瓊脂糖凝膠在轉移*幾分鐘的

時候配好,水浴加熱溶解,并保持燒杯中水處于沸騰狀態,至用之前再拿出來),再將 IPG 膠條緩

緩加入 SDS—PAGE 膠面,其中不斷補加 5%的瓊脂糖溶液,注意不能產生氣泡。

4.4 跑膠濃縮膠 13mA 分離膠 20mA 共約 5.5 個小時

5.銀染(兩根膠條所用劑量)(銀染特別注意用超純水)

5.1 固定 30min 無水乙醇 200ml+乙酸 50ml,用超純水定容至 500ml

5.2 敏化 30min 無水乙醇 150ml

Na2S2O3S226;5H2O 1.5688g

無水乙酸鈉 34g

先用水溶解 Na2S2O3S226;5H2O 和乙酸鈉,再加乙醇,后定容至 500ml

5.3 洗滌 5min × 3 次

5.4 銀染 20min AgNO3 1.25g 用超純水定容至 500ml

5.5 洗滌 1min × 2 次

5.6 顯影 無水 Na2CO3 12.5g 用超純水定容至 500ml

甲醛(37%)0.1ml,臨時加

5.7 終止 10min EDTA—Na2S226;2H2O 7.3g 用超純水定容至 500ml

5.8 洗滌 5min × 3 次

注:整個雙向電泳實驗中全部使用超純水,盡量減少離子的影響。

B. 實驗相關試劑配制1. Bradford 工作液

95%乙醇 25ml 先用乙醇溶解考馬斯亮蘭 G250,溶解完后再加磷

85%磷酸 52ml 酸,后超純水定容至 500ml。過濾后置于棕色瓶

考馬斯亮蘭 G250 0.035g 外加油皮紙保存(Bradford 不穩定,一周內有效)

2. 裂解液

尿素 8M

硫脲 2M

CHAPS 4%

DTT 60 mM

Tris—base 40 mM(如果有條件可以添加 PMSF 0.5mM 和 5%的 Pharmalate)

3.水化液儲液

尿素 8M

硫脲 2M

CHAPS 4%

Tris—base 40 mM

4.分離膠 buffer (pH8.8) 250ml

SDS 0.4% 1g

Tris—HCl 1.5M 45.4275g5.濃縮膠 buffer (pH6.8) 100ml

SDS 0.4% 0.4g

Tris—HCl 0.5M 6.07g

6.凝膠儲存液(30%的丙烯酰胺)250ml

Acr 29.2% 73g

Bis 0.8% 2g

7.電極緩沖液(跑一次要配制 2500ml)

甘氨酸 43.2g 36g

Tris 9g 或 7.5g

SDS 3g 2.5g

超純水定容至 3000ml 超純水定容至 2500ml

8. 0.5M Tris —HCl pH 6.8 儲液

6.1g Tris 先用 30ml 超純水溶解,再用 46ml,3M HCl 調 pH6.8,再加水定容至 100ml

9. 平衡液儲液

脲(即尿素)36g

甘油 30% 30ml

SDS 1% 1g

0.5M Tris—HCl pH6.8 10ml 超純水定容至 100ml

10.平衡液 A(一根膠條)

DTT 20mg

平衡液儲液 10ml

11.平衡液 B(一根膠條)碘乙酰氨 300mg

平衡液儲液 10ml

0.05%溴酚蘭 15μl (平衡液 A、B 均需臨時配制)

12.0.5%瓊脂糖 10ml

瓊脂糖 0.05g

電極緩沖液 10ml

溴酚蘭 25μl

補:4、5、6 的溶液需過濾后儲存于 4C 備用。

C. 藥品

CHAPS 兼性離子去垢劑 去垢劑可破壞蛋白質分子之間的疏水相互作用,

SDS 離子型去垢劑 提高蛋白質的溶解性,防止在等電聚焦時析出

尿素 離液劑 可改變或破壞氫鍵等次級鍵的結構,使蛋白質

硫脲 離液劑 變性并使蛋白失活。尿素和硫脲聯合使用,可

以大大增加蛋白質的溶解性

DTT 還原劑 斷裂蛋白質分子中 Cys 殘基之間形成的二硫鍵,增加蛋白質的溶解性。但過分

提高 DTT 的濃度,由于它 pKa 在 8 左右,因而會影響 pH 梯度。DTT 在堿性 pH 下會去質

子化,等電聚焦時會損耗,導致二硫鍵復原,蛋白質沉淀BSA Bradford 中制作標準曲線用

無水乙醇 和磷酸一起,提供 Bradford 中的環境

磷酸 提供 Bradford 中的酸性環境

Tris 構成緩沖液的成分,可用于抗衡 pH 的變化

IPG buffer

覆蓋液 即礦物油,防止水分蒸發,樣品干燥。

丙烯酰胺(Acr) 以丙烯酰胺為單體,甲叉二丙烯酰胺為交聯劑,

甲叉二丙烯酰胺 (Bis)在催化劑(Aps)和引發劑(TEMED)作用下,聚合交聯成三維

網狀結構

瓊脂糖

溴酚蘭 指示劑作用

碘乙酰氨(IAA)平衡液 B 中使用,中和 A 液中的 DTT

正丁醇 比聚丙烯酰胺密度小,用于凝膠制作過程中的壓膠

甘油 無機鹽的良好溶劑,熱穩定性好

Marker

考馬斯亮蘭 G250(Bradford 法用)考馬斯亮蘭 G250 有紅、藍兩種不同顏色的形式在一

定濃度的乙醇及酸性條件下,可配成淡紅色的溶液,當與蛋白結合后,產生藍色化合物,反

應迅速而穩定,反應化合物在 465~595nm 處有大的光吸收值,化合物顏色 深淺與蛋白

濃度的高低成正比關系,因此可檢測 595nm 的光吸收值的大小計算蛋白的含量

甘氨酸 與 Tris 構成緩沖系統AgNO3

EDTA 金屬螯合劑,可以結合銀離子,終止銀染過程。

 

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