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免疫共沉淀 Co-IP 實驗操作步驟

更新時間:2019-03-19瀏覽:1660次

免疫共沉淀 Co-IP 實驗操作步驟

一、原理:

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗體和抗原之間的專一性作用為ji

的用于研究蛋白質相互作用的經典方法。是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用

的有效方法。其原理是:當細胞在非變性條件下被裂解時,完整細胞內存在的許多蛋白質

-蛋白質間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質 X 的抗體免疫沉淀 X,那么與 X 在體

內結合的蛋白質 Y 也能沉淀下來。目前多用精制的 prorein A 預先結合固化在 argarose

的 beads 上,使之與含有抗原的溶液及抗體反應后,beads 上的 prorein A 就能吸附抗原

達到精制的目的。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質是否在體內結合;也可用于確定一

種特定蛋白質的新的作用搭檔。

其優點為:(1)相互作用的蛋白質都是經翻譯后修飾的,處于天然狀態;(2)蛋白

的相互作用是在自然狀態下進行的,可以避免人為的影響;(3)可以分離得到天然狀態

的相互作用蛋白復合物。缺點為:(1)可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質-蛋白質

相互作用;(2)兩種蛋白質的結合可能不是直接結合,而可能有第三者在中間起橋梁作

用;(3)必須在實驗前預測目的蛋白是什么,以選擇后檢測的抗體,所以,若預測不

正確,實驗就得不到結果,方法本身具有冒險性。

二、準備工作:

預冷 PBS,RIPA Buffer,細胞刮子(用保鮮膜包好后,埋冰下),離心機

1. 用預冷的 PBS 洗滌細胞兩次,后一次吸干 PBS;2. 加入預冷的 RIPA Buffer(1ml/107 個細胞、10cm 培養皿或 150cm2 培養瓶,

0.5ml/5×106 個細胞、6cm 培養皿、75cm2 培養瓶)

3. 用預冷的細胞刮子將細胞從培養皿或培養瓶上刮下,把懸液轉到 1.5EP 管中,4℃,

緩慢晃動 15min(EP 管插冰上,置水平搖床上)

4. 4℃,14000g 離心 15min,立即將上清轉移到一個新的離心管中

5. 準備 Protein A agarose,用 PBS 洗兩遍珠子,然后用 PBS 配制成 50%濃度,建

議減掉槍尖部分,避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠

6. 每 1ml 總蛋白中加入 100μl Protein A 瓊脂糖珠(50%),4℃搖晃 10min(EP

管插冰上,置水平搖床上),以去除非特異性雜蛋白,降低背景

7. 4℃,14000g 離心 15min,將上清轉移到一個新的離心管中,去除 Protein A 珠

8. (Bradford 法)做蛋白標準曲線,測定蛋白濃度,測前將總蛋白至少稀釋 1:10 倍

以上,以減少細胞裂解液中去垢劑的影響(定量,分裝后,可以在-20℃保存一個月)

9. 用 PBS 將總蛋白稀釋到約 1 μg/μl,以降低裂解液中去垢劑的濃度,如果興趣蛋白

在細胞中含量較低,則總蛋白濃度應該稍高(如 10 μg/μl)

10. 加入一定體積的兔抗到 500μl 總蛋白中,抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細胞

系中的多少而異

11. 4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫 2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建議用 2

h 室溫孵育12. 加入 100μl Protein A 瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復合物,4℃緩慢搖動抗原抗體混

合物過夜或室溫 1h,如果所用抗體為鼠抗或雞抗,建議加 2 μl"過渡抗體"(兔抗鼠 IgG,

兔抗雞 IgG)

13. 14000rpm 瞬時離心 5s,收集瓊脂糖珠-抗原抗體復合物,去上清,用預冷的

RIPA buffer 洗 3 遍,800μl/遍,RIPA buffer 有時候會破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復合物內

部的結合,可以使用 PBS

14. 用 60μl 2×上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復合物懸起,輕輕混勻,緩沖液的量

依據上樣多少的需要而定(60 μl 足夠上三道)

15. 將上樣樣品煮 5min,以游離抗原,抗體,珠子,離心,將上清電泳,收集剩余

瓊脂糖珠,上清也可以暫時凍-20℃,留待以后電泳,電泳前應再次煮 5min 變性。

RIPA Buffer 配制:

ji礎成分:

Tris-HCl(緩沖液成分,防止蛋白變性)

NaCl(鹽份,防止非特異蛋白聚集)

NP-40(非離子去污劑,提取蛋白;用 H2O 配制成 10%儲存液)

去氧膽酸鈉(離子去污劑,提取蛋白;用 H2O 配制成 10%儲存液;避光保存)

注意:準備激酶(致活酶)實驗時,不要加去氧膽酸鈉,因為離子型去污劑能夠使酶

變性,導致活性喪失。

RIPA 蛋白酶抑制劑苯甲jihuang酰氟(PMSF)(用異丙醇配制成 200mM 的儲存液,室溫保存)

EDTA(鈣螯合劑;用 H2O 配制成 100mM 的儲存液,PH 7.4)

亮抑酶肽(Leupeptin)(用 H2O 配制成 1mg/ml 的儲存液,分裝,-20℃保存)

抑蛋白酶肽(Aprotinin)(用 H2O 配制成 1mg/ml 的儲存液,分裝,-20℃保存)

胃蛋白酶抑制劑(Pepstatin)(用甲醇配制成 1mg/ml 的儲存液,分裝,-20℃保

存)

RIPA 磷酸(酯)酶抑制劑

激活的 Na3VO4(用 H2O 配制成 200mM 的儲存液,見 Sodium Orthovanadate

Activation Protoco)

NaF(200mM 的儲存液,室溫保存)

 

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