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蛋白質的表達、分離、純化實驗

更新時間:2019-03-18瀏覽:1769次

蛋白質表達、分離、純化可以:(1)探索和研究基因的功能以及基因表達調控的機理;

(2)供作結構與功能的研究;(3)作為催化劑、營養劑等。

實驗方法原理

攜帶有目標蛋白基因的質粒在大腸桿菌 BL21 中,在 37℃,IPTG 誘導下,超量表達攜

帶有 6 個連續組氨酸殘基的重組氯霉素酰基轉移酶蛋白,該蛋白可用一種通過共價偶連的

次氨基三乙酸(NTA)使鎳離子(Ni2+)固相化的層析介質加以提純,實為金屬熬合親和

層析(MCAC)。蛋白質的純化程度可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析。

實驗材料:大腸桿菌 BL21

試劑、試劑盒:LB 液體培養基

氨芐青霉素

Washing Buffer Elution Buffer IPTG

蒸餾水 胰蛋白胨 酵母粉氯化鈉

儀器、耗材:搖床 離心機層析柱離心管移液槍槍頭盒 燒杯 玻璃

實驗步驟

一、試劑準備

1. LB 液體培養基:Trytone 10 g, yeast extract 5 g,NaCl 10 g,用蒸餾水配至

1000 mL。

2. 氨芐青霉素:100 mg/mL。

3. 上樣緩沖液:100 mM NaH2PO4,10 mM Tris,8M Urea,10 mM 2-ME,pH8.0。

4. Washing Buffer:100 mM NaH2PO4,10 mM Tris,8 M Urea,pH6.3。

5. Elution Buffer:100 mM NaH2PO4,10 mMTris,8M Urea, 500 mM

Imidazole, pH8.0。

6. IPTG:100mM IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷):2.38g IPTG 溶于 100ml

ddH2O 中,0.22μm 濾膜抽濾,-20℃保存。

二、獲得目的基因

1. 通過 PCR 方法:以含目的基因的克隆質粒為模板,按基因序列設計一對引物(在

上游和下游引物分別引入不同的酶切位點),PCR 循環獲得所需基因片段。

2. 通過 RT-PCR 方法:用 TRIzol 法從細胞或組織中提取總 RNA,以 mRNA 為模板,

逆轉錄形成 cDNA 第1鏈,以逆轉錄產物為模板進行 PCR 循環獲得產物。三、構建重組表達載體

1. 載體酶切:將表達質粒用限制性內切酶(同引物的酶切位點)進行雙酶切,酶切產

物行瓊脂糖電泳后,用膠回收 Kit 或凍融法回收載體大片段。

2. PCR 產物雙酶切后回收,在 T4DNA 連接酶作用下連接入載體。

四、獲得含重組表達質粒的表達菌種

1. 將連接產物轉化大腸桿菌 DH5α,根據重組載體的標志(抗 Amp 或藍白斑)作篩

選,挑取單斑,堿裂解法小量抽提質粒,雙酶切初步鑒定。

2. 測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進入下步操作。否則應篩選更多克

隆,重復亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。

3. 以此重組質粒 DNA 轉化表達宿主菌的感受態細胞。

五、氯霉素酰基轉移酶重組蛋白的誘導

1. 接種含有重組氯霉素酰基轉移酶蛋白的大腸桿菌 BL21 菌株于 5 mL LB 液體培養

基中(含 100 ug/mL 氨芐青霉素),37℃震蕩培養過夜。

2. 按 1∶50 或 1:100 的比例稀釋過夜菌,一般轉接 1 mL 過夜培養物于 100 mL(含

100 ug/mL 氨芐青霉素)LB 液體培養基中,37℃震蕩培養至 OD600 = 0.6 - 0.8(

0.6,大約需 3 h)。取 10 ul 樣品用于 SDS-PAGE 分析。

3. 對照組不加誘導劑,實驗組加入 IPTG 至終濃度 0.5 mmol/l,37℃繼續培養 1-3h。

4. 12 000 rpm 離心 10 min,棄上清,菌體沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。

六、氯霉素酰基轉移酶重組蛋白的分離、純化

1. NTA 層析柱的準備:在層析柱中加入 1 mL NTA 介質,并分別用 8 mL 去離子水,

8 mL 上樣緩沖液洗滌。

2. 重組蛋白的變性裂解:在冰浴中凍融菌體沉淀,加入 5 mL 上樣緩沖液, 用吸管抽

吸重懸,超聲波破裂菌體,用振蕩器等輕柔的混勻樣品 60 min,4℃ 12000 rpm 離心 30

min,將上清吸至一個干凈的容器中,并棄沉淀。取 10 ul 上清樣品用于 SDS-PAGE 分析。3. 上清樣品以 10-15 mL/h 流速上 Ni2+-NTA 柱,收集流出液,取 10 ul 樣品用于

SDS-PAGE 分析。

4. 洗脫雜蛋白:用 Washing Buffer 以 10-15 mL/h 流速洗柱,直至 OD280 = 0.01

分步收集洗脫液,約 3-4 h,取 10 ul 洗脫開始時的樣品用于 SDS-PAGE 分析。

5. 洗脫目標蛋白:用 Elution Buffer 洗柱,收集每 1 mL 級分,分別取 10 ul 樣品用

于 SDS-PAGE 分析。

注意事項

1. 選擇表達載體時,要根據所表達蛋白的zui終應用考慮。如為方便純化,可選擇融合

表達;如為獲得天然蛋白,可選擇非融合表達。

2. 融合表達時在選擇外源 DNA 同載體分子連接反應時,對轉錄和轉譯過程中密碼結

構的閱讀不能發生干擾。

3. 菌液 OD 值要小于 1,否則細胞太濃太老,不易破碎,且質粒易丟失。

4. 誘導時間做一個梯度,不同蛋白誘導時間需摸索。

5. 誘導溫度適當摸索:25、30℃。

6. IPTG 濃度:一般在 1 mM 以內,可適當摸索。

7. 超聲條件可視實際情況改變,只要使菌體裂解充分即可,即菌液清亮不粘稠。

其他

一、原核表達

1. 原核表達簡介

將克隆化基因插入合適載體后導入大腸桿菌用于表達大量蛋白質的方法一般稱為原核表達。

這種方法在蛋白純化、定位及功能分析等方面都有應用。

2. 大腸桿菌用于表達重組蛋白的特點

(1)易于生長和控制;

(2)用于細菌培養的材料不及哺乳動物細胞系統的材料昂貴;(3)有各種各樣的大腸桿菌菌株及與之匹配的具各種特性的質粒可供選擇;

(4)在大腸桿菌中表達的蛋白由于缺少修飾和糖基化、磷酸化等翻譯后加工,常形成包涵

體而影響表達蛋白的生物學活性及構象。

3. 原核表達載體

通常為質粒,典型的表達載體應具有以下幾種元件:

(1)選擇標志的編碼序列;

(2)可控轉錄的啟動子;

(3)轉錄調控序列(轉錄終止子,核糖體結合位點);

(4)一個多限制酶切位點接頭;

(5)宿主體內自主復制的序列。

4. 原核表達一般程序

獲得目的基因-準備表達載體-將目的基因插入表達載體中(測序驗證)-轉化表達宿

主菌-誘導靶蛋白的表達-表達蛋白的分析-擴增、純化、進一步檢測

 

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