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Western blot 詳細操作步驟

更新時間:2019-03-18瀏覽:2419次

一個基因表達zhong極結果是產生相應的蛋白質(或酶)。因此檢測蛋白質是測定基因表

達的主要標志,檢測蛋白質的方法很多,除 ELISA 法外,也可用與檢測 DNA 和 RNA 相類

似的吸印方法。前兩法有“南”和“北”之意,故本法遂被延伸稱為 Western(西)印跡

法,該法能用 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨出與專一抗血清結合的專一性蛋白質。將聚丙

烯酰胺凝膠上分辨出的蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上并與第1抗體共孵。第1抗體專一地與

待分離蛋自質的抗原決定簇結合,然后用另一種蛋自質,如 135I-蛋白 A 或辣根過氧化物酶

連接的山羊抗 IgG 檢測已結合上去的抗體。本法所需時間 6 小時或過夜。

(一)蛋白質的聚丙烯酰胺凝膠電泳

幾乎所有蛋白質電泳分析都在聚丙烯酰胺凝膠上進行,而所用條件總要確保蛋白質解

離成單個多肽亞基并盡可能減少其相互間的聚集。zui常用的方法是將強陰離子去污劑 SDS

與某一還原劑并用,并通過加熱使蛋白質解離后再加樣于電泳凝膠上。變性的多肽與 SDS

結合并因此而帶負電荷,由于多肽結合 SDS 的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序

列無關,因此 SDS 多肽復合物在聚丙烯酰凝膠電泳中的遷移只與多肽的大小相關。在達到

飽和的狀態下,每克多肽約可結合 1.4 克去污劑,借助已知分子量的標準參照物,則可測算

出多肽鏈的分子量。

SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳大多在不連續緩沖系統中進行,其電泳槽緩沖液的 pH 值與

離子強度不同于配膠緩沖液,當兩電極間接通電流后,凝膠中形成移動界面,并帶動加入凝

膠的樣品中所含的 SDS 多肽復合物向前推進。樣品通過高度多孔性的積層膠后,復合物在

分離膠表面聚集成一條很薄的區帶(或稱積層)。曲于不連續緩沖系統具有把樣品中的復合

物全部濃縮于極小體積的能力,故大大提高了 SDS 聚丙烯酰胺凝膠的分辨率。zui廣泛使用的不連續緩沖系統zui早是由 Ornsstein(1964)和 Davis(1964)設計的,樣品

和積層膠中含 Tris-Cl(pH6.8),上下槽緩沖液含 Tris-甘氨酸(pH8.3),分離膠中含

Tris-Cl(pH8.8)的。系統中所有組分都含有 0.1%的 SDS(Laemmli,1970),樣品和積層膠中

的lv離干形成移動界面的先導邊界而甘氨酸分子則組成尾隨邊界,在移動界面的兩邊界之間

是一電導較低而電位滴度較陡的區域,它推動樣品中的多肽前移并在分離膠前沿積聚,此處

pH 值較高,有利于甘氨酸的離子化,所形成的甘氨酸離子穿過堆集的多肽并緊隨lv離子之

后,沿分離膠泳動。從移動界面中解脫后,SDS 多肽復合物成一電位和 pH 值均勻的區帶

泳動穿過分離膠,并被篩分而依各自的大小得到分離。

【材料】

分離膠及積層膠溶液

水飽和異丁醇

1×Tris?Cl/SDS,pH8.8

蛋白質分子量標準混合物

1×SDS 電泳緩沖液

電泳裝置及夾子、玻璃板、灌膠支架、緩沖液槽等附件

0.75mm 封邊墊片

0.75mm 樣品梳子

50µl 微量進樣器

恒流電源

【常用試劑】

1)30%丙烯酰胺/0.8% N,N’-亞甲丙烯酰胺將 30 克丙烯酰胺和 0.8 克 N,N’-亞甲丙烯酰胺溶于總體積為 60ml 的水中,加熱至

37℃溶解之,補加水至終體積為 100ml。0.45µm 微孔濾膜過濾除菌,查證該溶液 pH 應

不大于 7.0,置棕色瓶中保存。

小心:丙烯酰胺具有很強的神經毒性并可通過皮膚吸收,其作用具有累積性。稱量丙

烯酰胺和 N,N’-亞甲丙烯酰胺時應戴手套和面具。可認為聚丙烯酰胺無毒,但也應謹慎操

作,因為它還可能含有少量未聚合材料。

2)4×Tris?Cl/SDS,pH8.8,

在 300mlH2O 中溶解 91g Tris 堿(1.5mol/L),用 1mol/L 調節 pH 至 8.8,補加 H2O 至

體積 500ml。用 0.45μm 濾膜過濾溶液,再加入 2g SDS[0.4%(w/v)],于 4℃可保存 1 月。

3)4×Tris?Cl/SDS,pH6.8,

在 40mlH2O 中溶解 6.05g Tris 堿(0.5mol/L),用 1mol/L 調節 pH 至 6.8,補加 H2O

至體積 100ml。用 0.45μm 濾膜過濾溶液,再加入 0.4g SDS[0.4%(w/v)],于 4℃可保存 1

月。

4)4×SDS 電泳緩沖液

Tris base 24.2 g

Glycerin 115.3 g

20%SDS 20 ml

加水至總體積 1000ml。

應用時稀釋 4 倍即為 1×SDS 電泳緩沖液(Tris 0.05M,Glycerin 0.38M,SDS 0.1%)。

5)TEMED (N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)

TEMED 通過催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺和 N,N’-亞甲丙烯酰胺的聚

合。6)10%過硫酸銨

過硫酸銨提供驅動丙烯酰胺和亞甲丙烯酰胺聚合所必需的自由基。可用去離子水配制

小量 10%(w/v)的貯存液并保存于 4℃。由于過硫酸銨會緩慢分解,故應隔周新鮮配制。

【步驟】

1)按廠商的使用指南用兩塊干凈的玻璃,平板和 0.75mm 墊片組裝電泳裝置中的玻

璃平板夾層,并固定在灌膠支架上。

2)按表 7.1 配制分離膠液體并脫氣,然后加入 10%的過硫酸銨和 TEMED,輕輕攪拌

混勻。

聚丙烯酰胺分離膠的配制

試劑成分 配制不同濃度分離膠所需試劑(ml)

5% 8% 10% 12% 15%

Acry:Bis (30:0.8) 2.50 4.00 5.00 6.00 7.50

4×Tris?Cl/SDS,pH8.8 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75

H2O 8.75 7.25 6.25 5.25 3.75

10%過硫酸銨 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05

TEMED 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01

按所需分離的蛋白質分子大小選擇合適的丙烯酰胺百分比濃度,一般地,5%的凝膠可

用于 60~200kDa 的 SDS 變性蛋白質分子的分離,10%用于 16~70kDa,15%用于 12~

45kDa。

3)用一根巴斯德吸管立即將分離膠液體沿夾層中一條墊片的邊緣加入于玻璃平板夾層

中,至凝膠約 5cm 高為止。樣品體積少于 10μl 不需灌制積層膠。4)用另一根已斯德吸管,先從一邊的墊片,再從另一邊墊片往夾層的液面頂部緩緩加

入一層水飽和異丁醇(厚約 1cm)。讓凝膠在室溫聚合 30min。

聚合后,可見在頂層異丁醇與凝膠的界面間有一清晰的折光線,膠的聚合失敗往往問

題在于過硫酸按或 TEMED,或兩者都有。

5)傾去頂層的異丁醇,并以 1×Tris-Cl/SDS,pH8.8 緩沖液沖洗凝膠的頂部表面,盡量用

吸水紙吸干。

6)按表 7.2 配制積層膠液體,用吸管將液體沿一條墊片加入到玻璃平板夾層,直至夾

層的頂部。

聚丙烯酰胺積層膠的配制

GEL%(3.9%) Total (10.05ml)

Acry:Bis(30:0.8) 1.30 ml

4×Tris?Cl/SDS,pH6.8 2.50 ml

H2O 6.10 ml

10%過硫酸銨 0.05 ml

TEMED 0.01 ml

7)將 0.75mm 厚的梳子插入夾層的積層膠液體中,必要時,再補加積層膠液體充盈剩

余空間。讓積層膠室溫聚合 30min。

8)在具螺口蓋的微量離心管中,用 2×SDS 加樣緩沖液按 1:1(v/v)稀釋待測蛋白質樣品,

于 100℃煮沸 5-10min。如樣品是蛋白質沉淀物,加入 50~100µl 1×SDS 加樣緩沖液溶

解之,并同樣在 100℃煮沸 5-10min。按供應商的使用指南用 2×SDS 加樣緩沖液溶解蛋白

質分子量標準混合物。對于 0.3cm 寬的加樣孔,推薦加樣體積以不超過 20µl 為宜。用考馬斯亮藍染色法顯

跡,成分很復雜的蛋白質混合物需加 25~50µg,而樣品中只有一種或不多的幾種蛋白的話,

只需 1~10µg 蛋白量。采用銀染顯跡時,樣品用量可減小 10~100 倍(按樣品的復雜程度

在小于 20µl 的體積溶有 0.01~0.5ng 蛋白樣品不等)。

2×SDS 加樣緩沖液(loading buffer)配制:

成分 體積(ml)

0.5M Tris?Cl (pH6.8) 12.5

20%SDS 11.5

Glycerin 10

2% Blue-Bromo-phenol 2.5

β-mercaptoethanol * 5.0

加 H2O 至總體積 50 ml,分裝

*β-mercaptoethanol 在臨用前加入。

9)小心拔出梳子,避免撕裂聚丙烯酰胺凝膠加樣孔。取出梳子后,以 1×SDS 電泳電

泳緩沖液沖洗加祥孔,并以此緩沖液充滿之。

10)按廠商指南將凝膠板固定到電泳裝置的上緩沖液室(上槽),同時往下緩沖液室

(下槽)加入推薦量的 1×SDS 電泳緩沖液。

11)將固定于上槽的凝膠板放入下槽中,并往上槽加入部分電泳緩沖液至剛好淹沒凝

膠的加樣孔。

12)用帶平嘴針頭的 50µl 注射器將同樣濃度的蛋白質樣品等體積加入到樣品孔中,小

心加樣使樣品在孔的底部成一薄層,對照孔加入蛋白質分子量標準樣品,如有空置的加樣孔,

須加等體積的空白 1×SDS 樣品緩沖液,以防相鄰泳道樣品的擴散。13)再往上槽加入余下的 1×SDS 電泳緩沖液。此操作緩慢小心,以防沖起樣品孔中的

樣品。

14)連接電源,對于 0.75mm 厚的垂直板電泳,先在 60V 下電泳至溴酚藍染料從積

層膠進入分離膠,再將電壓調至 120V 繼續電泳至溴酚藍到達凝膠底部為止。

15)關閉電源并撤去連接的導線,棄去電泳緩沖液。連同上槽一起將凝膠夾層取出。

16)將凝膠定位以便識別加樣的順序,將凝膠板從上槽解離出來,放在一疊吸水紙或

紙巾上。

17)小心將封邊的墊片抽出一半,并以此為杠桿橇起上面的玻璃平板,使凝膠暴露出

來。

18)小心從下面的玻璃平板上移出凝膠,在凝膠的一角切去一小塊以便在染色及干膠

后仍能認出加樣次序,接著就可進行蛋白質的檢測。

(二)蛋白質從 SDS 聚丙烯酰胺凝膠轉移至固相支持體

目前進行的Western印跡反應大多還是從凝膠上直接把蛋白質電轉移至硝酸纖維素濾

膜之上。把凝膠的一面與硝酸纖維素濾膜相接觸,然后將凝膠及與之相貼的濾膜夾于濾紙、

兩張多孔墊料以及兩塊塑料板之間。把整個結合體浸泡于配備有標準鉑電極并裝有 pH8.3

的 Tris-甘氨酸緩沖液的電泳槽中,使硝酸纖維素濾膜靠近陽極一側,然后接通電流約 0.5

小時。在此期間,蛋白質從凝膠中向陽極遷移而結合下硝酸纖維素濾膜上。為了防止過熱并

因而導致在夾層中形成氣飽,轉移過程應在冷室中進行。

【步驟】

1)當 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳行將結束時,用蒸餾水淋洗電極板,然后用不被吸收

的紙巾揩干電極板上粘附的液滴。2)戴上手套,切 6 張濾紙和 1 張硝酸纖維素濾膜,其大小都應與凝膠大小*吻合。

如果濾紙或濾膜面積大于凝膠,濾紙和濾膜伸出的邊緣就大有機會相接觸,造成電流短路而

使蛋白質不能從凝膠向濾膜轉移。用鉛筆在濾膜一角作好標記。拿取凝膠、濾紙和硝酸纖維

素濾膜時必須戴手套。因為皮膚上的油脂和分泌物會阻止蛋白質從凝膠向濾膜轉移。

3)把硝酸纖維素濾膜漂浮于一盤去離子水的水面上,借毛細作用使之從下往上濕潤后,

將之浸沒于水中,浸泡 5 分鐘以上以驅除留于濾膜上的氣泡。

4)在一淺托盤中加入少量轉移緩沖液,把 6 張濾紙浸泡于其中。

轉移緩沖液

190 mmol/L 甘氨酸

25 mmol/L Tris 堿

20% 甲醇

配制 IL 轉移緩沖液,需稱取 14.4g 甘氨酸、3g Tris 堿,并加入 200ml 甲醇,加水至

總量為 1L。

5)戴上手套按如下方法安裝轉移裝置:

a.平放底部電極(陰極),放一張海綿墊片。

b.在海綿墊片上放置 3 張用轉移緩沖液浸泡過的濾紙,逐張疊放,精確對齊,然后用

一玻璃移液管作滾筒以擠出所有氣泡。

d.從電泳槽上撤出放置 SDS 聚丙烯酰胺凝膠的玻璃,把凝膠轉移到一盤去離子水中略

為漂洗一下,然后準確平放于硝酸纖維素濾膜上。把凝膠左下角置于硝酸纖維素濾膜的標記

角上,戴手套排除所有氣泡。切記:為避免發生短路,不要切去凝膠的左下角。

c.把硝酸纖維素濾膜放在聚丙烯酰胺凝膠上,要保證精確對齊,而且在硝酸纖維素濾膜

與聚丙烯酰胺凝膠之間并不留有氣泡。e.把zui后 3 張 3 濾紙放在硝酸纖維素濾膜上方,同樣須確保備層精確對齊并不留氣泡。

6)將靠上方的電極(陽極)放于夾層物上,連接電源。根據凝膠面積按 300mA 接通

電流,電轉移 0.5-1.0 小時。

7)斷開電源并拔下槽上插頭,從上到下拆卸轉移裝置,逐一掀去各層。將凝膠轉移至

盛有考馬斯亮藍染液的托盤中,進行染色,以便檢查蛋白質轉移是否*。

8)可做可不做:取出硝酸纖維素濾膜置于一張干凈的濾紙上,于室溫干燥 30-60 分

鐘,使硝酸纖維素濾膜干燥,據稱可以改善濾膜在隨后的處理中保留蛋白質的能力;但是,

這也可能導致蛋白質進一步變性并因此改變其免疫反應性,所以干燥濾膜對某些蛋白質/抗

體組合來說可能是優點,但對另一些組合則可能是缺點,此一時而彼一時,只能針對具體靶

蛋白根據實驗來決定。

9)切去濾膜的左下角,以免鉛筆標記被抹去。

(三)對固定于硝酸纖維素濾膜上的蛋白質進行染色

可供對固定于硝酸纖維素濾膜上的蛋白質進行染色的方法有多種,但僅有麗春紅 S 染

色法可與所有免疫學檢測方法兼容,這是因為該染料只會短暫顯色而且在進行 Western 印

跡時可被洗去。因此,麗春紅 S 染色并不影響隨后用于檢測抗原的顯色反應,這些顯色反

應是由已偶聯抗體的堿性磷酸酶或乳過氧化物酶等催化的。然而,由于其顯示的紫紅色不容

易拍攝下來,這種染色不能提供yong久性實驗記錄,而只能提供蛋白質轉移情況的直觀證據并

對蛋白質分子量標準參照物進行定位,標準蛋白在硝酸纖維秦濾膜上的位置可用鉛筆或不褪

色的墨水標記下來。

【步驟】

1)如果硝酸纖維素濾膜已干,則把它漂浮于一盤去離子水的水面上,通過毛細作用使

濾膜自下而上濕潤。然后把濾膜浸泡于水中,浸泡 5 分鐘以上以驅除留于其上的氣泡。2)把濾膜轉移到含有麗春紅 S 使用液的托盤中染色 5-10 分鐘,其間輕輕搖動染液。

混合下列成分,配成麗春紅 S 貯存液(10×):

麗春紅 S 2g

三lv乙酸 30g

磺基水楊酸 30g

加水至 100ml

用 1 份上述貯存液加 9 份去離子水即成麗春紅 S 使用液,使用后應予廢棄。

3)蛋白帶出現后,于室溫用去離子水漂洗硝酸纖維素濾膜,其間換水數次。

4)用防水性印度墨汁標出作為分子量標準的參照蛋白的位置。

(四)封閉硝酸纖維紊濾膜的免疫球蛋白結合位點

正如從 SDS 聚丙烯酰胺凝膠轉移出來的蛋白質可以與硝酸纖維素濾膜結合一樣,免疫

學檢測試劑中的蛋向質同樣也能與之結合。Western 印跡法的靈敏度取決于封閉可能結合

非相關蛋白的位點以降低這類非特異性結合背景的效果。現已設計的封閉液有多種,其中脫

脂奶粉zui為價廉物美,既使用方便又可與通常使用的所有免疫學檢測系統兼容。只有一種情

況,也就是當牛奶中可能含有要用 Westem 印跡法檢測的蛋白質時,不能使用脫脂奶粉作

為封閉劑。

【步驟】

1)把硝酸纖維素濾膜放入可以加熱封接的塑料袋中,根據濾膜面積以 0.1ml/cm2

量加入封閉液,盡可能排除里面的氣泡,然后密閉袋口,平放在平緩搖動的搖床平臺上于室

溫溫育 1 小時。

封閉液

0.25%(w/v)卡塞因(Caesin)0.01%疊氮鈉(小心:疊氮鈉有毒,使用時應戴手套謹慎操作,含有疊氮鈉的溶液應

標記清楚。)

溶于 pH7.4 的 PBS 中。

如果免疫探針的非特異結合背景仍然太高以致難以接受,可加入 Tween-20 至終濃度

為 0.02%。在大多數情況下,加入這種去污劑不至影響抗體與靶抗原的特異性結合。

2)剪開塑料袋,棄去封閉液,立即加入抗靶蛋白杭體溶液與濾膜一同溫育。

(五)抗體和靶蛋白的結合

實際上,Western 印跡膜的檢測分兩步進行:首先靶蛋白特異性的非標記抗體在封閉

液中先與硝酸纖維素濾膜一同溫育。經洗滌后,再將濾膜與二級試劑――放射性標記的或與辣

根過氧化物酶或堿性磷酸酶偶聯的抗免疫球蛋白抗體或 A 蛋白一同溫育。進一步洗滌后;

通過放射自顯影或原位酶反應來確定抗原-抗體-抗體或抗原-抗體-A 蛋白復合物在硝酸纖

維素濾膜上的位置。

間接法即兩步檢測法的主要優點是使用單個二級試劑則可測定多種多樣的第1抗體,

從而免卻了逐一純化并標記各種第1抗體之累。因為向廠商購置的二級免疫試劑,價格頗為

低廉,所以可大大節約時間和金錢。

1.用抗靶蛋白的第1抗體與硝酸纖維素濾膜共溫育的方法

1)在裝有用上頁所述方法處理過的硝酸纖維素濾膜的塑料袋中,按每平方厘米 0.1ml

的量加人封閉液和適量的第1抗體。

應進行預實驗并按實際情況確定第1抗體的加量,推薦使用以下稀釋度:

a.多克隆抗體:1:100-1:5000。

b.雜交瘤細胞培養上清液:不稀釋一 1:100。

c.雜交瘤小鼠的腹水:1:1000―1:10,000。2)盡可能排除藏匿的氣泡后密封袋口,將臆膜平放在乎緩搖動的搖床平臺上,于 37℃

溫育 1~2 小時。

3)剪開塑料袋,廢棄封閉液和抗體,用 25ml PBS 漂洗濾膜 3 次,每次 10 分鐘。

4)按下面介紹的方法,立即用二級免疫試劑與濾膜一同溫育。

2.用二級免疫試劑與硝酸纖維素膜溫育的方法

二級試劑(通常是抗兔疫球蛋白抗體或 A 蛋白)可用 125I 進行放射性標記,也可與辣

根過氧化物酶或堿性磷酸酶共價偶聯。與酶共價偶聯的免疫球蛋白和 A 蛋白均有商品出售。

(1)酶聯二級試劑

1)經 PBS zui后一次洗滌后,把硝酸纖維素濾膜轉移到裝有 PBS 溶液的托盤中,于室

溫平緩搖動溫育 10 分鐘。切記在加入酶聯第二試劑之前須清除濾膜上的疊氮鈉。

2)把濾膜轉移至一個可以加熱封接的塑料袋,按濾膜面積加入 0.1ml/cm2 無疊氮鈉

的封閉液。

3)根據廠家說明書加入酶聯二級試劑,如果使用塑料袋則應予封口。二級試劑的稀釋

度一般推薦用 1:200-1:2000。

4)于 37℃ 平緩搖動、將濾膜與酶聯二級試劑一同溫育 1 小時。

5)把濾膜轉移至 PBS 溶液。于室溫平緩擺動,溫育 10 分鐘。重復 3 次,每次更換新

的 PBS 溶液。

6)按下文介紹的方法加入合適的生色底物。

3.酶聯抗體生色底物的使用

(1)堿性磷酸酶經免疫反應固定的堿性磷酸酶可催化底物 5-溴-4-lv-3-吲跺磷酸/氮藍

四唑(BCIP/NBT)在原位轉變為深藍色化合物。

1)配制下列 3 種溶液:NBT 在 10 ml 70%的二甲基甲酰胺中溶解 0.5g NBT。

BCIP 在 10 ml 100%的二甲基甲酰胺中溶解 0.5BCIP。

堿性磷酸酶緩沖液

100 mmol/L NaCl

5 mmol/L MgCl2

100 mmol/L Tris-Cl (pH9.5)

放在密閉容器中保存于室溫,這一溶液是穩定的。

2)取 66µl NBT 溶液與 10 ml 堿性磷酸酶緩沖液混勻,加入 33µl BCIP 溶液。這一生

色底物混合液應在 30 分鐘內使用。

3)把經洗滌的硝酸纖維素濾膜[本頁頁首步驟 5]轉移至一淺托盤上,按濾膜面積加入

0.1ml/cm2 的生色底物混合物,于室溫平緩搖動進行溫育。

4)細心觀察反應過程,一俟蛋白帶的顏色深度達到要求(約 20 分鐘),則把濾膜移

到另一托盤中,內裝有 200µl 0.5mol/L EDTA(pH8.0)和 50ml PBS。

5)拍攝濾膜照片留作yong久實驗記錄。

(2)辣根過氧化物酶免疫偶聯的辣根過氧化物酶zui敏感的底物是 3,3'-二氨基聯苯胺,它

在過氧化物酶所在部位轉變成棕色沉淀。在鈷或鎳離子存在下進行反應可以加深沉淀的顏色

并提高反應的靈敏度。但是,使用辣根過氧化物酶不可能*排除背景顏色,因此須十分小

心地觀察生色反應,一俟特異性染色蛋白帶清晰可見,就應盡快終止生色反應。

1)在 9ml 的 0.0l mol/L Tris-Cl(pH7.6)溶液中溶解 6mg 的二氨基聯苯胺(臨用前

配制)。

2)用濾紙過濾底物溶液以去除可能形成的沉淀物。3)加入 10µl 30%H2O2 ,混勻后立即使用。得到的 30%H2O2 溶液,應保存于密閉

的棕色瓶中,數周后應予廢棄。

4)把經漂洗的硝酸纖維素濾膜移至一淺托盤上,按濾膜面積加入 0.1 ml/cm2的底物

溶液,于室溫輕輕搖動溫育之。

5)細心觀察反應過程,一俟蛋白帶的顏色深度達到要求(約 1-3 分鐘),即用水略為

漂洗,然后把濾膜轉移到 PBS 中。

6)拍攝濾膜照片,留作yong久實驗記錄。過氧他物酶染色的蛋白帶經日光照射數小時后

將褪去顏色。

 

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