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細胞增殖檢測:MTT 法

更新時間:2019-03-16瀏覽:2168次

MTT 分析法以活細胞代謝物還原劑 3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di

phenytetrazoliumromide, MTT 噻唑藍為基礎。MTT 為黃色化合物,是一種接受氫離

子的染料,可作用于活細胞線粒體中的呼吸鏈,在琥珀酸脫氫酶和細胞色素 C 的作用下

tetrazolium 環開裂,生成藍色的 formazan 結晶,formazan 結晶的生成量僅與活細胞數

目成正比(死細胞中琥珀酸脫氫酶消失,不能將 MTT 還原)。還原生成的 formazan 結晶

可在含 50%的 N,N-二甲基甲酰胺和 20%的十二甲基磺酸鈉(pH 4.7)的 MTT 溶解液中

溶解,利用酶標儀測定 490 nm 處的光密度 OD 值,以反映出活細胞數目。也可以用 DMSO

來溶解。

MTT 粉末和溶液保存時都需要避光,用鋁箔紙包好就可以。實驗的時候我一般關閉超凈臺

上的日光燈來避光,覺得這樣比較好。

一、步驟

1、接種細胞

用含 10%胎小牛血清得培養液配成單個細胞懸液,以每孔 1000-10000 個細胞接種到 96

孔板,每孔體積 200ul。

2、培養細胞

同一般培養條件,培養 3-5 天(可根據試驗目的和要求決定培養時間)。

3、呈色

培養 3-5 天后,每孔加 MTT 溶液(5mg/ml 用 PBS 配)20ul.繼續孵育 4 小時,終止培

養,小心吸棄孔內培養上清液,對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內培養上清液。每孔加

150ul DMSO,振蕩 10 分鐘,使結晶物充分融解。

4、比色選擇 490nm 波長,在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值,記錄結果,以時間為橫坐標,

吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

二、注意事項

1、選擇適當得細胞接種濃度。

2、避免血清干擾:一般選小于 10%的胎牛血清的培養液進行試驗。在呈色后盡量吸盡孔內

殘余培養液。

3、設空白對照:與試驗平行不加細胞只加培養液的空白對照。其他試驗步驟保持一致,zui

后比色以空白調零。

MTT 實驗吸光度zui后要在 0-0.7 之間,超出這個范圍就不是直線關系,

IC50 是半抑制率,意思是抑制率 50%的時候藥物的濃度。把藥品稀釋成不同的濃度,然后

計算各自的抑制率,以藥品的濃度為橫坐標,抑制率為縱坐標作圖,然后得到 50%抑制率

時候的藥品濃度,就是 IC50。要點:藥品 2 倍稀釋,多做梯度,做點線圖即可!

三、舉例

各組濃度 0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001,稀釋倍數為 10,zui大濃度為

0.1,抑制率為 0.95、0.80、0.65、0.43、0.21,0.06。代入計算公式:

Pm=0.95

Pn=0.06

P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1

Xm=lg0.1=-1

lgI=lg0.1/0.01=1

lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025

IC50=0.00025有一個公式可供參考;

lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)

Xm:lg zui大劑量

I:lg(zui大劑量/相臨劑量)

P:陽性反應率之和

Pm:zui大陽性反應率

Pn:zui小陽性反應率

抑制率=1-加藥組 OD 值/對照組 OD 值

公式中的zui大zui小陽性反應率就是zui大zui小抑制率

例:

用 96 孔板培養 SMMC-7721 肝癌做 MTT 測細胞活力,應該加多少 1640 培養基,多少

MTT 和 DMSO 合適?根據書上說的加 200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加 DMSO 之

前要盡量去掉培養液,便于 DMSO 溶解甲臜顆粒進行比色測定

一般每孔 4000 個細胞為宜,既細胞濃度在 20000 個/ml,MTT 加 20ul,作用四小時后洗

掉上清液,注意不要將甲瓉洗掉,然后每孔加 150ul DMSO,在脫色搖床上振蕩 10 分鐘,

然后測吸光值。

一般要低于 IC50,避免非調亡性殺傷的細胞太多,造成流式細胞儀檢測碎片太多。我一般

用 1/2-1/3 的 IC50,作用時間為 36h。一般腫瘤細胞系空白處理的調亡率應低于 1%,用

藥后一般為 5-10%(Annexin V),細胞周期的亞 G0 峰比較明顯。

MTT 法心得MTT 實驗是檢測細胞活力的實驗方法,由于細胞活力與細胞數呈正相關,因此也常常用來

檢測細胞的增殖情況。

一、MTT 的原理

活細胞有琥珀酸脫氫酶,將 MTT 還原成棕褐色沉淀。由于一般介紹園子里已經很多,筆者

將自己的心得按照實驗流程與大家交流交流。

二、MTT 法檢測細胞增殖實驗的注意事項

1、培養好細胞點板

養細胞沒啥好說的,如果不知道細胞如何養,那就看看相關的文獻方法。如果知道了細胞的

名字,就可以上 檢索細胞的培養信息,這個網站上的培養方法是標準培養方

法。當然可以根據自己實驗要求進行修改。由于細胞計數很繁瑣,點板時的細胞濃度是zui難

掌握的,這一點筆者的心得如下:

自己先將細胞養一段時間,大概了解細胞的增殖情況,在 MTT 檢測時實際上要求細胞大概

能長滿 96-孔板的 80-90%,如果打算養 48 小時就檢測,根據細胞的生長情況反推點板時

的細胞濃度狀況。這時可以將細胞不進行計數,將消化好的細胞混勻后(可能是 10ml)直

接在一個廢棄(進行過無菌處理)的 96 孔板中依次加入 180、100、50 微升細胞,將

細胞放置幾分鐘就會沉到板底了,這時在顯微鏡下觀察,推測哪個孔的細胞 48 h 能基本長

滿板底,假設 50 微升的孔比較合適,而點板時沒孔需點 200 微升,那么就將細胞濃度再

稀釋 4 倍就可以正式點板了,這時順便將細胞進行計數(因為實驗記錄要求寫啊)。這樣

就 OK 了!如果細胞還太多,將細胞稀釋 4 倍后再重復以上操作。注意:不要過分信賴細胞

計數,因為細胞計數的取樣量為 20 微升左右,由于顆粒的分布不均勻,代表性是很差的。

建議:細胞計數一定要會,但不要*依賴它。點板時一定要將細胞消化成單個細胞,而且一定要混勻,用排槍,否則,MTT 的 SD

會狂大!

2、點板布局

其實這一點很多人不懈一顧。如果你的細胞要養 48 h 或更長,建議不要吝嗇 96-孔板的四

周邊孔,這 32 個邊孔不能使用,建議加入滅菌 PBS 以飽和中間 64 個孔的水分。因為細胞

培養過程中,邊孔的水分蒸發很快,培養液及里面的藥物會出現濃縮現象,細胞的狀況就復

雜了,有些人稱之為%26ldquo;邊緣效應%26rdquo;這些孔的 SD 也會狂大,既然如此,

不如不用。

3、加 MTT

如果確認你考察的藥物沒有氧化還原性,你可以直接加入 MTT 溶液(總體積的 1/10),

如果你沒有把握,建議在加 MTT 前換一次液;如果你肯定考察的藥物的氧化還原性很強,

比如谷胱甘肽、Vit E、VitC,那建議你用 PBS 將細胞洗洗,否則這些藥物會將 MTT 還原

成棕褐色沉淀,這種效果可能是你不需要的。

4、加入 MTT 后的反應

時間為 3-4h,此時棄去各孔中的液體在加入 200 微升的 DMSO。為了將沉淀溶解*,

盡可能將水棄除干凈,加入 DMSO 后在搖床上震搖 10min。提醒:如果你的細胞貼壁不好,

此時的沉淀在棄去液體時易丟失,因此貼壁不好的細胞在點板時記得將 96 孔板用多聚賴氨

酸處理處理,要么在棄液體時先用甩板機離心,再輕輕棄去液體。關于 DMSO 的量,每孔

的體積有點兒差異不干擾檢測,只要能將沉淀*溶解就行了。至于 DMSO 的體積差異不

同為什么不影響檢測值已經被數學證明了,在此我不多說,如果有人不明白我再證明給他看。

當然為了養成良好的實驗習慣,DMSO 的體積還是一致的好。

5、檢測 MTT還原的 MTT 在 460-630 均有較好的吸收,如果你的酶標儀是濾光片,可以選 470 nm 左

右或 630 nm 左右的濾光片,如果酶標儀有單波長,你可以在檢測前掃描一下吸收譜,選

用zui大細說波長檢測就是了,zui大波長,大概在 550nm 附近,必要時加一個參比波長以扣

除非特異性吸收。

6、吸收值分析

在理想的 MTT 實驗中,如果是細胞抑制實驗,不加藥物處理組的吸收值應該在 0.8-1.2 左

右,太小檢測誤差占的比例較多,太大吸收值可能已經超出線性范圍。這個原理在朗伯-比

爾定律中有解釋。

7、建議

如果你覺得 MTT 中出現的問題不好解決,那么建議你做 CCK-8 實驗,原理與 MTT 相似,

但操作上簡化些,當然,費用也稍微高一些。

 

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