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細胞凋亡檢測實驗(Annexin V/PI 雙染色法)

更新時間:2019-03-16瀏覽:3670次

細胞凋亡檢測可以:(1)用于腫瘤細胞和組織在內的不同種類病理標本研究;(2)應用

于臨床診療,新藥研制、生物制品開發、腫瘤放化療、以及從促凋亡角度探索腫瘤的基因治

療;(3)對相關疾病的早期發現、放化療的療效評價具有舉足輕重的地位。

1、實驗方法和原理

細胞凋亡早期改變發生在細胞膜表面,目前早期識別仍有困難。這些細胞膜表面的改變之一

是磷脂酰絲氨酸(PS)從細胞膜內轉移到細胞膜外,使 PS 暴露在細胞膜外表面。PS 是一

種帶負電荷的磷脂,正常主要存在于細胞膜的內面,在細胞發生凋亡時細胞膜上的這種磷脂

分布的不對稱性被破壞而使 PS 暴露在細胞膜外。

Annexin V 是一種 Ca+依賴的磷脂結合蛋白,初發現是一種具有很強的抗凝血特性的血

管蛋白,Annexin V 具有易于結合到磷脂類如 PS 的特性。對 PS 有高度的親和性。因此,

該蛋白可充當一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的 PS。

PS 轉移到細胞膜外不是凋亡所*的,也可發生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式間的差

別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的,而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就破壞了。

因此,可以建立一種用 Annexin V 結合在細胞膜表面作為凋亡的指示并結合一種染料排除

試驗以檢測細胞膜的完整性的檢測方法。

2、實驗材料、試劑、儀器和耗材

細胞;

HEPES 緩沖液、NaCl、CaCl2、PI、ANNEXIN V-FITC 試劑盒;

流式細胞儀。3、實驗步驟

一、試劑與儀器

1. 孵育緩沖液:10 mmol/L HEPES/NaOH,pH7.4,140 mmol/L NaCl,5 mmol/L CaCl2。

2. 標記液:將 FITC- Annexin V(寶靈曼公司產品)和 PI 加入到孵育緩沖液中,終濃度均

為 1 ug/ml。

3. 流式細胞儀。

二、實驗步驟

1. 細胞收集:懸浮細胞直接收集到 10 ml 的離心管中,每樣本細胞數為(1~5)×106/mL

500~1 000 r/min 離心 5 min,棄去培養液。

2. 用孵育緩沖液洗滌 1 次,500~1 000 r/min 離心 5 min。

3. 用 100 ul 的標記溶液重懸細胞,室溫下避光孵育 10~15 min。

4. 500~1 000 r/min 離心 5 min 沉淀細胞孵育緩沖液洗 1 次。

5. 加入熒光(SA-FLOUS)溶液 4℃下孵育 20 min,避光并不時振動。

6. 流式細胞儀分析:流式細胞儀激發光波長用 488 nm,用一波長為 515 nm 的通帶濾器

檢測 FITC 熒光,另一波長大于 560 nm 的濾器檢測 PI。

7. 結果判斷:凋亡細胞對所有用于細胞活性鑒定的染料如 PI 有抗染性,壞死細胞則不能。

細胞膜有損傷的細胞的 DNA 可被 PI 著染產生紅色熒光,而細胞膜保持完好的細胞則不會

有紅色熒光產生。因此,在細胞凋亡的早期 PI 不會著染而沒有紅色熒光信號。正常活細胞

與此相似。在雙變量流式細胞儀的散點圖上,左下象限顯示活細胞,為(FITC-/PI-);右

上象限是非活細胞,即壞死細胞,為(FITC+/PI+);而右下象限為凋亡細胞,顯現(FITC+/PI-)。

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