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大腸桿菌轉化實驗(熱擊法)

更新時間:2019-03-13瀏覽:2469次

大腸桿菌轉化可以:(1)將重組 DNA 分子導入大腸桿菌受體細胞進行復制,增殖和表達,

以獲得目的基因;(2)驗證大腸桿菌感受態細胞效果;(3)用于分子生物學其他研究。

1 原理:

質粒 DNA 粘附在細菌細胞表面,經過 42°C 短時間的熱擊處理,促進吸收 DNA.然后在非

選擇培養基中培養一代,待質粒上所帶的抗菌素基因表達,就可以在含抗菌素的培養基中生

長。

2 器材:

旋渦混合器,微量移液取樣器,移液器吸頭,1.5ml 微量離心管,雙面微量離心管架,干

式恒溫氣浴(或恒溫水浴鍋),制冰機,恒溫搖床,培養皿(已鋪好固體 LB-Amp),超

凈工作臺,酒精燈,玻璃涂棒,恒溫培養箱。

3 材料和試劑:

質粒 DNA,重組 DNA,培養基(不加抗菌素),LB 培養基(加抗菌素),無菌 ddH2O,

IPTG,X-gal。

4 實驗準備:

無菌 ddH2O,1.5ml 離心管裝入鋁制飯盒(滅菌)、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒(滅菌),

20%IPTG(M/V),2% X-gal(M/V,用 N,N-二甲基甲酰胺配)。

5 操作步驟:

(1)事先將恒溫水浴的溫度調到 42℃。

(2)從-70℃ 超低溫冰柜中取出一管(100μl)感受態菌,立即用手指加溫融化后插入冰

上,冰浴 5~10min。(3) 加入 5μl 連接好的質粒混合液(DNA 含量不超過 100ng),輕輕震蕩后放置冰上

20min。

(4)

輕輕搖勻后插入 42℃水浴中 1~2min 進行熱休克,然后迅速放回冰中,靜置 3~5min。

(5) 在超凈工作臺中向上述各管中分別加入 500μl LB 培養基(不含抗菌素)輕輕混勻,

然后固定到搖床的彈簧架上 37℃震蕩 1h.

(6) 在超凈工作臺中取上述轉化混合液 100~300μl,分別滴到含合適抗菌素的固體 LB

平板培養皿中,用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻(注意:玻璃涂布棒上的酒精熄滅后稍

等片刻,待其冷卻后再涂)。

(7)

如果載體和宿主菌適合藍白斑篩選的話,滴完菌液后再在平板上滴加 40μl 2% X-gal,

8μl 20% IPTG,用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻。

(8) 在涂好的培養皿上做上標記,先放置在 37℃恒溫培養箱中 30-60min 直到表面的液

體都滲透到培養基里后,再倒置過來放入 37℃恒溫培養箱過夜。

(9) 在被細菌污染的桌面上噴灑 70%乙醇,擦干桌面,寫實驗報告。

(10)觀察平板上長出的菌落克隆,以菌落之間能互相分開為好。注意白色菌斑。

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