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大腸桿菌感受態細胞制備實驗(CaCl2 法)

更新時間:2019-03-13瀏覽:2002次

細胞經過一些特殊方法(電擊法、CaCl2 法)等處理后,細胞膜的通透性發生了暫時性的改

變,成為能允許外源 DNA 分子進入的細胞,即感受態細胞(Compenent cells)。

1 實驗方法原理:

帶有外源 DNA 的重組質粒,在體外構建后,導入宿主細胞,隨著細胞的大量復制、繁殖,

才能夠有機會獲得純的重組質粒 DNA,該過程稱之為轉化過程。受體細胞經過一些特殊方

法(如:CaCl2,RuCl 等化學試劑)的處理后,細胞膜的通透性發生變化,能容許外源 DNA

的載體分子通過。

2 實驗材料、試劑、儀器耗材:

E. coli DH5α 菌株

LB 固體培養基、LB 液體培養基、CaCl2、硫酸鎂、SOB、TFB 等

培養皿、恒溫搖床、聚丙烯管、電熱恒溫培養箱、臺式高速離心機、無菌工作臺、燒瓶、恒

溫水浴鍋、低溫冰箱、制冰機、分光光度計、微量移液槍、錐形瓶、試管等

3 實驗步驟:

1、從 37℃培養 16-20 h 的平板中挑取一個單菌落(直徑 2-3 mm),轉到一個含有 100 ml LB

或 SOB 培養基的 1L 燒瓶中。于 37℃劇烈振搖培養 3 h。一般經驗,1 OD600 約含有大腸

桿菌 DH5α 109 個/mL。

2、將細菌轉移到一個無菌、一次性使用的、用冰預冷的 50 ml 聚丙烯管中,在冰上放置

10 min,使培養物冷卻至 0℃。

3、于 4℃用 Sorvall GS3 特頭(或與之相當的轉頭)以 4 100 r/min 離心 10 min,以回收

細胞。

4、倒出培養液,將管倒置 1 min 以使后的痕量培養液流盡。5、每 50 ml 初始培養液用 30 ml 預冷的 0.1 mol/LCaCl2-MgCl2 溶液(80 mmol/L MgCl2,

20 mmol/L CaCl2)重懸每份細胞沉淀。

6、于 4 ℃用 Sorvall GS3 轉頭(或與之相當的轉頭)以 41 00 r/min 離心 10 min,以回

收細胞。

7、倒出培養液,將管倒置 1 min 以使后的痕量培養液流盡。

8、每 50 ml 初始培養物用 2 ml 用冰預冷的 0.1 mol/L CaCl2(或 TFB)重懸每份細胞沉淀。

9、此時,可以用新鮮制備的感受態細胞直接做轉化實驗,也可以將細胞凍存于- 70℃。

4 注意事項:

1. 為達到高效轉化,活細胞數務必少于 10 8 個細胞/mL,對于大多散大腦桿菌來說,這相

當于 OD 值為 0.4 左右。為保證細菌培養物的生長密度不致過高,可每隔 15-20 min 測定

OD600 值來監測,用監測的時間及 OD 值列一個圖表,以便預測培養物的 OD600 值到 0.4

的時間,當 OD600 值達到 0.35 時,收獲細菌培養物。

2. 在菌株與菌株之間,OD 值與每毫升中活細胞散間的關系變化很大,因此有必要通過漶

量特定腦桿菌的生長培養物在生長周期的不同時相的 OD600 值,并將各稀釋維度的培養物

鋪于無抗生素的 LB 瓊脂板以計算每一時相的活細胞散,從而使分光光度計讀數得到標準化。

3. 對大多數大腸桿菌(MC106 除外),采用 TFB 代替 CaCl2 可得到相同或更好的結果。

Dagert 和 Ehrlieh 的實驗(1979)曾表明,細胞可以于 4℃在 CaCl2 溶液中保存 24-48 h,

在貯存的初 12-24 h 內,轉化率增加 4-6 倍,然后降低到初始水平。

4. 克隆的新鮮程度,一定要選新鮮平板的單克隆,即剛涂布生長過夜的平板。

5. 菌體的 OD600 值,JM109 或 BL21,OD 值為 0.35,DH5α 為 0.4,要盡量保證 OD

值不要過高,更不能超過 0.6。

6. 低溫處理的時間,做完后冰上保存 12-24 h 后分裝,并保存于-80℃。7. 試劑和用品,所有的用品(離心管、藥瓶等)用新的,如果使用舊的,要確保干凈,CaCl2

溶液。

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