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畢氏酵母(Pichia pastoris)感受態細胞制備及轉化

更新時間:2019-03-13瀏覽:1955次

1、畢氏酵母氯化鋰轉化法

(1)試劑

1M LiCl(用去離子蒸餾水配制,濾膜過濾除菌;必要時用消毒去離子水稀釋)

50% PEG3350(Sigma P3640 用去離子蒸餾水配制,濾膜過濾除菌,用較緊的蓋子的瓶

子分裝)

2mg/ml salmon sperm DNA / TE(10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA)-20℃保存

注:醋酸鋰對畢氏酵母無效,僅氯化鋰有效;PEG3350 可屏蔽高濃度 LiCl 的毒害作用;

(2)感受態畢氏酵母的制備

接種 Pachia pastoris 到 50ml YPD 培養基中,30℃搖菌過夜(約 24~28h)培養到 OD

值為 0.8~1.0(約 108 Cells/ml);

收獲細胞,用 25ml 無菌水洗滌一次,室溫下 1500g 離心 10min;

重懸細胞于 1ml 100mM LiCl 溶液中,將懸液轉入 1.5ml 離心管;

離心機大速度離心 15 秒沉淀菌體,重懸菌體于 400ul 100mM LiCl 溶液中;

按 50ul/管分裝,立即進行轉化;

注:不要將感受態酵母菌冰浴;

(3)畢氏酵母的轉化

煮沸 1ml 鮭魚精 DNA 5min,迅速冰浴以制備單鏈擔體 DNA;

將感受態酵母菌離心,以 Tips 去除殘余的 LiCl 溶液;

對于每一個轉化,按以下順序加入:

50% PEG3350 240ul

1M LiCl 36ul2mg/ml 單鏈 Salmon sperm DNA 25ul

5~10ug/50ul H2O 質粒 DNA 50ul

劇烈旋渦混勻直至沉淀菌體*分布均勻(約 1min);

30℃水浴孵育 30min;

42℃水浴熱休克 20~25min;

6000~8000rpm 離心收集酵母菌體;

重懸酵母于 1ml YPD 培養基,30℃搖床孵育;

1~4h 后,取 25~100ul 菌液鋪選擇性培養基平板,于 30℃培養 2~3 天鑒定;

2、畢氏酵母 PEG1000 轉化法

(1)試劑

緩沖液 A:1.0M Sorbitol,10mM Bicine,pH8.35(sigma),3%(v/v)ethylene glycol

緩沖液 B:40%(w/v)PEG1000(sigma),0.2M Bicine,pH8.35

緩沖液 C:0.15M NaCl,10mM Bicine,pH8.35

未污染的新鮮、試劑級 DMSO,-70℃保存

注:

緩沖液 A、B、C 均用濾膜過濾,-20℃保存;

將 DNA 直接加在凍結的酵母細胞上是本實驗的關鍵之處(即使在冰上解凍的待轉化細胞,

其攝取外源 DNA 的能力也在解凍過程中迅速下降;如進行多樣品的轉化,建議按 6 樣品/

組進行);

(2)待轉化畢氏酵母的制備

接種環接種 Pachia pastoris 于 YPD 平板,30℃培養 2d;

挑取單克隆酵母菌株于 10mlYPD 培養基中,30℃振蕩培養過夜;取步驟 2 中小量菌液接種到 100mlYPD 培養基中振蕩培養,待其 OD 值從 0.1 升到 0.5~

0.8;

室溫下 3000g 離心收集酵母菌體,50ml 緩沖液 A 洗滌一次;

重懸菌體于 4ml 緩沖液 A 中,按 0.2ml/管分裝于 1.5ml 的離心管中,每管加入 11ulDMSO,

混合后迅速于液氮中冷凍,

-70℃保存

(3)畢氏酵母的轉化

將約 50ug 線性化質粒 DNA 溶于 20ul TE 或水中,直接加于凍結的酵母細胞中;加入擔體

DNA(40ug 變性超聲線性化鮭魚精 DNA)以獲得大轉化率;

37℃水浴孵育 5min,中間混合樣品 1~2 次;

取出離心管,加入 1.5ml 緩沖液 B,*混勻;

30℃水浴孵育 1h;

室溫下 2000g 離心 10min,去除上清液,菌體沉淀重懸于 1.5ml 緩沖液 C 中;

離心樣品,去除上清液,輕微操作將樣品重懸于 0.2ml 緩沖液 C 中;

將所有轉化液鋪于選擇性平板,于 30℃孵育 3~4 天后,鑒定;

3、畢氏酵母電轉化法

(1)E.coli *0F’感受態細胞的制備

取 10ul *0F’菌液,接種于 200ml LB 液體培養基中活化培養,37℃,200 rpm,16~

18 小時。取 100ul 菌液接種于 200ml 液體 LB 培養基中。

37℃,200 rpm,培養 16~18 小時。

滅菌 500 ml 離心管,4℃,4000 rpm,20 min。得菌體沉淀。棄上清,菌體用 10%甘油

重懸并洗滌。重復洗滌 3 次。第三次離心后,棄絕大部分上清,留下約 1ml 液體用于重懸菌體。

從制得得感受態細胞中,取 200ul 于滅菌 EP 管中,加入連接反應產物 5ul,混勻,不要產

生氣泡,在冰上放置 5min。

將混勻后得 200ul 菌液移入電擊杯中。

使用電擊穿孔儀進行轉化,設置為電壓 2500 V,時間 5 ms。

電擊后,往電擊杯中加入 800ul SOC 培養基,沖洗出菌體,轉移至滅菌 1.5 ml EP 管中。

37℃,150 rpm ,輕搖 45~60 min。

取全部均勻涂布于含 Zeocin 25 ug/ml 的 LLB-Zeocin 平板上,正放,待涂布液不在流

動,37℃ 培養 12~16 小時。

(2)線性化質粒 DNA 對 Pichia pastorisGS115 的轉化

取新鮮制備的(或-70℃凍存的)感受態細胞置于冰浴中,使其*解凍;

1)將 100μl 菌體移出至一新的無菌 Eppendorf 管中,加入 5-20μg 線性化質粒(5~10μl),

輕彈混勻,盡數吸出轉移到 0.2cm 型的電穿孔轉化杯中;

2) 轉化杯置于冰浴中 5~10 分鐘,保持低溫。

3) 電穿孔轉化電擊條件:電壓:1500V;電阻:400Ω;電容:25μF;脈沖時間:10mS;

一次電擊。

4) 電擊后,馬上在電擊轉化杯中加入 1ml 4℃預冷的 1M 的山梨醇溶液,用微量移液槍吹

打均勻,置于冰浴中;

5) 取 30℃烘至表面半干的 MD 培養基平板,在超凈工作臺上無菌操作涂布平板,400μl/

3.4 畢赤酵母電轉化方法

3.4.1 菌體的準備:1. 挑取酵母單菌落,接種至含有 5ml YPD 培養基的 50ml 三角瓶中,30℃、250-300r/min

培養過夜;

2. 取 100-500μl 的培養物接種至含有 500ml 新鮮培養基的 2L 三角搖瓶中,28~30℃、

250-300r/min 培養過夜,至 OD600 達到 1.3~1.5;

3. 將細胞培養物于 4℃,1500g 離心 5min,用 500ml 的冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸;

4. 按步驟 3 離心,用 250ml 的冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸;

5. 按步驟 3 離心,用 20ml 的冰預冷的 1mol 的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸;

6. 按步驟 3 離心,用 1ml 的冰預冷的 1mol 的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸,其終體積約為

1.5ml;

7. 備注:可將其分裝為 80μl 一份的包裝冷凍起來,但會影響其轉化效率(2 周之內)。

3.4.2 電擊轉化:

8. 將 5~20μg 的線性化 DNA 溶解在 5~10μl TE 溶液中,與 80μl 的上述步驟 6 所得的菌

體混勻,轉至 0.2cm 冰預冷的電轉化杯中;

9. 將電轉化杯冰浴 5min;

10. 根據電轉化儀提供的資料,參考其他文獻及多次摸索,確定合適的電壓、電流、電容等

參數,按優化的參數,進行電擊;

11. 電擊完畢后,加入 1ml 冰預冷的山梨醇溶液將菌體混勻,轉至 1.5ml 的 EP 管中;

12. 將菌體懸液涂布于 MD 或 RDB 平板上,每 200~600μl 涂布一塊平板;

13. 將平板置于 30℃培養,直至單個菌落出現。

推薦:電壓 1.5kV;電容 25μF;電阻 200Ω。電擊時間為 4~10msec

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