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IPTG 誘導蛋白表達的原理及方法步驟

更新時間:2019-03-12瀏覽:6423次

IPTG 誘導蛋白表達的原理及方法步驟

E.coli 的乳糖操縱子(元)含 Z、Y 及 A 三個結構基因,分別編碼半乳糖苷酶、透酶和乙酰

基轉移酶,此外還有一個操縱序列 O、一個啟動序列 P 及一個調節基因 I。I 基因編碼一種

阻遏蛋白,后者與 O 序列結合,使操縱子(元)受阻遏而處于關閉狀態。在啟動序列 P 上

游還有一個分解(代謝)物基因激活蛋白(CAP)結合位點。由 P 序列、O 序列和 CAP 結

合位點共同構成 lac 操縱子的調控區,三個酶的編碼基因即由同一調控區調節,實現基因產

物的協調表達 。在沒有乳糖存在時,lac 操縱子(元)處于阻遏狀態。此時,I 序列在 PI

啟動序列操縱下表達的 Lac 阻遏蛋白與 O 序列結合,阻礙 RNA 聚合酶與 P 序列結合,抑

制轉錄起動。當有乳糖存在時,lac 操縱子(元)即可被誘導。在這個操縱子(元)體系中,

真正的誘導劑并非乳糖本身。乳糖進入細胞,經 b-半乳糖苷酶催化,轉變為半乳糖。后者

作為一種誘導劑分子結合阻遏蛋白,使蛋白構象變化,導致阻遏蛋白與 O 序列解離、發生

轉錄。異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一種作用*的誘導劑,不被細菌代謝而十分穩定,

因此被實驗室廣泛應用。

材料

1、誘導表達材料

( 1 ) LB (Luria—Bertani))培養基

酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10g

NaCl 10g 瓊脂 (Agar) 1-2%

蒸餾水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0

適用范圍:大腸桿菌

( 2 ) IPTG 貯備液:2 g IPTG 溶于 10 mL 蒸餾水中,0 . 22 μm 濾膜過濾除菌,分裝成 1

mL /份,-20 ℃ 保存。( 3 ) l× 凝膠電泳加樣緩沖液:

50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )

50 mmol / L DTT

2 % SDS (電泳級)

0.1 % 溴酚藍

10 % 甘油

2、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白純化材料

1 )酶溶法

(1)裂解緩沖液:

50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )

1 mmol / L EDTA

100 mmol / LNaCI

(2)50 mmol / L 苯甲ji huang酰氟(PMSF )。

(3)10 mg / mL 溶菌酶。

(4)脫氧膽酸。

(5)1 mg / mL DNase I。

2 )超聲破碎法

( 1 ) TE 緩沖液。

( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝膠電泳加樣緩沖液:

100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )

100 mmol / L DTT

4 %SDS0.2 % 溴酚藍

20 % 甘油

實驗方案

1、外源基因的誘導表達

( 1 )用適當的限制性內切核酸酶消化載體 DNA 和目的基因。

( 2 )按連接步驟連接目的基因和載體,并轉化到相應的宿主菌。

( 3 )篩選出含重組子的轉化菌落,提取質粒 DNA 作限制性內切核酸酶圖譜,DNA 序列

測定,

確定無誤后進行下一步。

( 4 )如果表達載體的原核啟動子為 PL 啟動子,則在 30 -32 ℃ 培養數小時,使培養液的

OD600 達 0.4-0.6 ,迅速使溫度升至 42 ℃ 繼續培養 3 -5h ;如果表達載體的原核啟動

子為 tac 等,則 37 ℃培養細菌數小時達到對數生長期后加 IPTG 至終濃度為 1 mmol / L。

繼續培養 3 -5h 。

( 5 )取上述培養液 1 mL , 1000g 離心,1 min ,沉淀,加 100 μL 聚丙烯酰胺凝膠電泳

上樣緩沖液后,作 SDS -PAGE 檢測。

2、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白質純化

1 )細菌的裂解

常用方法有:① 高溫珠磨法;② 高壓勻漿;③ 超聲破碎法;④ 酶溶法;⑤ 化學滲透等。

前三種方法屬機械破碎法,并且方法① 、② 已在工業生產中得到應用,后三種方法在實驗

室研究中應用較為廣泛。下面介紹酶溶法和超聲破碎法的實驗步驟。

(1)酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶;β-1,3 -葡聚糖酶;β-1,6 -葡聚糖酶;蛋白酶;殼多

糖酶;糖昔酶等。溶菌酶主要對細菌類有作用,而其他幾種酶對酵母作用顯著。主要步驟為:① 4 ℃ ,5000rpm 離心,15 min ,收集誘導表達的細菌培養液(100 mL )。棄上清,

約每克濕菌加 3 mL 裂解緩沖液,懸浮沉淀。

 

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