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質粒轉染大腸桿菌

更新時間:2019-03-12瀏覽:3318次

材料試劑:胰化蛋白胨,酵母提取物,瓊脂,NaCl,NaOH(調 pH),氨芐青霉素,卡那

霉素,質粒提取試劑盒

儀器:高壓滅菌鍋,42℃恒溫水浴鍋,,恒溫搖床(37℃,225rpm),無菌培養板,消毒 1.5ml

離心管,消毒槍頭,無菌操作臺

實驗步驟:

1. LB 培養基的配制:

在 950 ml 去離子水中加入: 胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g 搖

動容器直至溶質溶解.用 5mol/LNaOH 調 pH 至 7.0.用去離子水定容至 1L.在 15psi 高

壓下蒸汽滅菌 20min.

固態培養基

LB 固體培養基及倒板 :

(1).配制:100mlLB 培養基加入 1.5g 瓊脂粉

(2).抗生素的加入:高壓滅菌后,將融化的 LB 固體培養基置與 55℃的水浴中,待培

養基溫度降到 55℃時(手可觸摸)加入氨芐抗生素(終濃度為 50μg/ml),以免溫度過

高導致抗生素失效,并充分搖勻。

(3)

.倒板:一般 10ml 倒 1 個板子。培養基倒入培養皿后,打開蓋子,在紫外下照 10-15

分鐘。

(4).保存:用封口膠封邊,并倒置放于 4℃保存,一個月內使用。

2. 從-70℃冰箱中取 200μl 感受態細胞懸液,室溫下使其解凍,解凍后立即置冰上。

3. 加入質粒 DNA 溶液(含量不超過 50ng,體積不超過 10μl),輕輕搖勻,冰上放置 30

分鐘后。4. 42℃水浴中熱擊 45s/90s,熱擊后迅速置于冰上冷卻 3-5 分鐘。

5. 向管中加入 1ml LB 液體培養基(不含 Amp),混勻后 37℃振蕩培養 1 小時,使細菌恢

復正常生長狀態,并表達質粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr )。

6. 將上述菌液搖勻后取 100μl 涂布于含 Amp 的篩選平板上,正面向上放置半小時,待菌

液*被培養基吸收后倒置培養皿,37℃培養 16-24 小時。

同時做兩個對照:

對照組 1: 以同體積的無菌雙蒸水代替 DNA 溶液,其它操作與上面相同。此組正常情

況下在含抗生素的 LB 平板上應沒有菌落出現。

對照組 2: 以同體積的無菌雙蒸水代替 DNA 溶液,但涂板時只取 5μl 菌液涂布于不

含抗生素的 LB 平板上,此組正常情況下應產生大量菌落。

大腸桿菌的擴增

1. 從 LB 平板上挑取新活化的單個菌落,接種于 3-5ml LB 液體培養基中,37℃下振蕩

培養 12 小時左右,直至對數生長后期。將該菌懸液以 1:100-1:50 的比例接種

于 100ml LB 液體培養基中,37℃振蕩培養 2-3 小時至 OD600 =0.5 左右。

2. 取上述培養液置于冰中 10min,之后轉移到已滅菌的 50ml 離心管中再于冰上放置

5min

3. 于 4℃離心,2700rmp,10min,棄上清,收集細菌

4. 質粒的提取

準備大腸桿菌質粒提取盒和擴增的帶質粒大腸桿菌培養液

5. 質粒鑒定(瓊脂糖凝膠電泳)

質粒轉染細胞株

材料 細胞株、質粒、培養基、鏈霉素/青霉素(雙抗)、FCS(小牛血清)、PBS(磷

酸鹽緩沖溶液)、胰酶/EDTA 消化液、轉染試劑(Lipofectamine TM2000

實驗步驟

Ⅰ.準備細胞:

貼壁細胞:轉染前 24 h,在 500 µL 無雙抗*培養基中接種 0.5-2×105 個細胞,

轉染時細胞融合度為 80 - 90% 。 ( 注:鋪板時要將細胞消化*混勻,避免細胞

堆積生長。)

II .對于每個轉染樣品,按下面的方法準備:

(1)用 50 µL Opti-MEM 稀釋 0.8 µg 質粒 DNA,輕輕吹吸 3 - 5 次混勻,室溫下

靜置 5 min。

(2)輕輕顛倒混勻轉染試劑,用 50 µL Opti-MEM 稀釋 2.0 µL Lipofectamine

TM2000,輕輕吹吸 3 - 5 次混勻,室溫下靜置 5 min。

(3)混合轉染試劑和質粒 DNA 稀釋液,輕輕吹吸 3 - 5 次混勻,室溫下靜置 20

min。注: 轉染復合物一旦形成,應立即加入培養皿中進行細胞轉染。

(4)轉染復合物加入到 24 孔細胞板中,100 µL/孔,前后輕搖細胞板混合均勻。

(5)將細胞板置于 37℃、5% CO2 培養箱中培養 6 h 左右,進行換液,換成含 10%

血清的普通培養基,在 37℃,5%CO2 孵育箱中繼續培養 24h 左右。

穩定轉染細胞株的篩選(各種細胞用什么抗生素篩選呢)

從 37℃,5%CO2 孵育箱中取出培養皿,棄去含轉染試劑的培養基,用 PBS 沖洗細胞

2 遍,胰蛋白酶消化,接種 1/2 的細胞到 100 mm 培養皿中,加入含 500 µg/ml G418 的

新鮮培養基,每 2-3 天更換一次新的篩選培養基,每天觀察細胞的死亡情況。當正常細胞*死亡后,換用新的不含 G418 的培養基培養。每天觀察細胞生長狀態。在細胞達到 60%

匯合率時再用含 500 µg/ml G418 的培養基篩選一次。當細胞達到 90%以上匯合率時將細

胞轉移至培養瓶中繼續培養(轉染后 10-12 天左右)。以后每隔 4-5 天再用含 500 µg/ml

G418 的培養基篩選。直到穩定表達轉染質粒的細胞達到一定數量后可以收集樣品(約轉染

后 15 天左右)。以后繼續培養時加入的 G418 濃度降一半。

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