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細胞轉染操作方法

更新時間:2019-03-12瀏覽:1326次

轉染 ,是將外源性基因導入細胞內的一種專門技術。隨著基因與蛋白功能研究的深入,轉

染目前已成為實驗室工作中經常涉及的基本方法。轉染大致可分為物理介導、化學介導和生

物介導三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因槍屬于通過物理方法將基因導入細胞的范例;

化學介導方法很多,如經典的磷酸鈣共沉淀法、脂質體轉染方法、和多種陽離子物質介導的

技術;生物介導方法,有較為原始的原生質體轉染,和現在比較多見的各種病毒介導的轉染

技術。

理想細胞轉染方法,應該具有轉染效率高、細胞毒性小等優點。病毒介導的轉染技術,是目

前轉染效率zui高的方法,同時具有細胞毒性很低的優勢。但是,病毒轉染方法的準備程序復

雜,常常對細胞類型有很強的選擇性,在一般實驗室中很難普及。其它物理和化學介導的轉

染方法,則各有其特點。

需要指出的一點,無論采用哪種轉染技術,要獲得*的轉染結果,可能都需要對轉染條件

進行優化。影響轉染效率的因素很多,從細胞類型、細胞培養條件和細胞生長狀態,到轉染

方法的操作細節,都需要考慮。

一、細胞傳代

1. 試驗準備:200ul/1mlTip 頭各一盒(以上物品均需高壓滅菌),酒精棉球,廢液缸,試管

架,微量移液器,記號筆,培養皿,離心管。

2. 棄掉培養皿中的培養基,用 1ml 的 PBS 溶液洗滌兩次。

3. 用 Tip 頭加入 1ml Trypsin 液,消化 1 分鐘(37,5%CO2 )。用手輕拍培養瓶壁,觀察

到細胞*從壁上脫落下來為止。

4. 加入 1ml 的含血清培養基終止反應。

5. 用 Tip 頭多次吹吸,使細胞*分散開。6. 將培養液裝入離心管中,1000rpm 離心 5min。

7. 用培養液重懸細胞,細胞計數后選擇 0.8X106 個細胞加入一個 35mm 培養皿。

8. 將合適體積*培養液加入離心管中,混勻細胞后輕輕加入培養皿中,使其均勻分布。

9. 將培養皿轉入 CO2培養箱中培養,第二天轉染。

二、細胞轉染

1. 轉染試劑的準備

① 將 400ul 去核酸酶水加入管中,震蕩 10 秒鐘,溶解脂狀物。

② 震蕩后將試劑放在-20 攝氏度保存,使用前還需震蕩。

2. 選擇合適的混合比例(1:1-1:2/脂質體體積:DNA 質量)來轉染細胞。在一個轉染管

中加入合適體積的無血清培養基。加入合適質量的 MyoD 或者 EGFP 的 DNA,震蕩后在加

入合適體積的轉染試劑,再次震蕩。

3. 將混合液在室溫放置 10―15 分鐘。

4. 吸去培養板中的培養基,用 PBS 或者無血清培養基清洗一次。

5. 加入混合液,將細胞放回培養箱中培養一個小時。

6. 到時后,根據細胞種類決定是否移除混合液,之后加入*培養基繼續培養 24-48 小

時。

三、第二次細胞傳代

1. 在轉染后 24 小時,觀察實驗結果并記錄綠色熒光蛋白表達情況。

2. 再次進行細胞傳代,按照免疫染色合適的密度 0.8X105個細胞/35mm 培養皿將細胞重

新轉入培養皿中。

3. 在正常條件下培養 24 小時后按照染色要求條件固定。轉染方法 原理

主要應用 特點

DEAE-

葡聚糖法

帶正電的 DEAE-葡聚糖與核

酸帶負電的磷酸骨架相互作用

形成的復合物被細胞內吞

瞬時轉染

相對簡便、重復比磷酸鈣好,但對

細胞有一定的毒副作用,轉染時需除

血清且一般只用于 BSC-1,CV-1,

COS 細胞系

磷酸鈣法

磷酸鈣 DNA 復合物吸附細胞

膜被細胞內吞

穩定轉染,

染瞬轉染

不適用于原代細胞(所需的 DNA 濃

度較高),操作簡便但重復性差,有

些細胞不適用

細胞建議用 CSCL 梯度離心,轉染是

拷貝數較多

陽離子脂

質體法

帶正電的脂質體與核酸帶負

電的磷酸基團形成復合物,然

后脂質體上剩余的電核與細胞

膜上的唾液酸殘基的負電核結

合;另一種解釋是通過細胞是

內吞作用而被進入細胞。(若

DNA 濃度過高,中和脂質體表

面電核,而降低了與細胞的結

合能力)

穩定轉染,

瞬時轉染,

所有細胞

使用方法簡單,可攜帶大片段

DNA,通用于各種類型的裸露 DNA

或 RNA,能轉染各種類型的細胞,

沒有免疫原性。雖在體外基因轉染中

有很高的效率,但在體內,能被血清

清除,并在肺組織內累積,誘發強烈

的抗炎反應,導致高水平的毒性,這

在很大程度上限制了其應用

陽離子聚

合物

帶正電的聚合物與核酸帶負

電的磷酸基團形成帶正電的復

穩定轉染,

瞬時轉染,

除了具有陽離子脂質體的轉染效

率高,操作簡單,適用范圍廣,重復合物后與細胞表面帶負電的蛋

白多糖相互作用,并通過內吞

作用進入細胞。

所有細胞 性好等特點外,還具有在體內,轉染

效率高,細胞毒性低等特點,是新一

代的轉染試劑。

逆轉

錄病

(RNA)

通過病毒中膜糖蛋白和宿主

細胞表面的受體相互作用而進

入宿主細胞,之后反轉入酶啟

動合成 DNA 并隨機整合到宿

主基因組中

穩定轉染,

特定宿主

細胞

可用于難轉染的細胞、原代細胞,

體內細胞等,但攜帶基因不能太大

(<8kb),細胞需處分裂期,需考

慮安全因素

腺病

毒(雙

DNA)

先和細胞表面的受體結合,繼

而在 αv 整合素介導下被細胞

內吞

瞬時轉染,

特定宿主

細胞

可用于難轉染的細胞,需考慮安全

因素

Biolistic

顆粒傳遞

法 (基因

槍粒子轟

擊法)

將 DNA 用顯微重金屬顆粒沉

淀,再將包被好的顆粒用彈道

裝置投射入細胞,DNA 在胞內

逐步釋放,表達

瞬時性轉

染,穩定轉

可用于:人的表皮細胞,纖維原細

胞,淋巴細胞系以及原代細胞

顯微注射

用顯微操作將 DNA 直接注入

靶細胞核

穩定轉染,

瞬時轉染

轉染細胞數有限,多用于工程改造

或轉基因動物的胚胎細胞

電穿孔法

高脈沖電壓破壞細胞膜電位,

DNA 通過膜上形成的小孔導

穩定轉染,

瞬時轉染,

適用性廣,除了質粒外,還可轉染

大的基因組(>65kb)但細胞致死率入

所有細胞 高,DNA 和細胞用量大, 需根據

不同細胞類型優化電穿孔實驗條件,

拷貝數較少 1-20

 

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