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Caco-2 細胞轉運模型一點小事

更新時間:2019-03-11瀏覽:2252次

                                 想研究藥物口服吸收?Caco-2 細胞模型來

作者:葉軍 

Caco-2 細胞轉運模型是被國外制藥企業以及實驗室應用的模擬腸道吸收的藥物篩選模 型,已廣泛應用于藥物在小腸吸收的評價和轉運機制研究中。Caco-2 細胞的結構和功能類似 于人小腸上皮細胞,含有與小腸刷狀邊緣上皮相關的酶系。 

與正常的成熟小腸上皮細胞在體外培育過程中出現的逆向分化不同,Caco-2 細胞在多孔可滲 透的聚碳酸酯膜上培養 3 周后可以自發分化為腸上皮細胞,形成致密的細胞單層,進而可用 作腸道轉運模型(圖 1)。 Caco-2 細胞模型培養和驗證方法簡單,與體內動物實驗相比更為 方便、經濟。 

 

1. Caco-2 細胞培養 

1) 采用 MEM *培養液(含 10%胎牛血清、1%非必須氨基酸、1%丙酮酸鈉、1%谷氨酰胺 和 1%青-鏈霉素)在 37℃和 5% CO2 條件下培養 Caco-2 細胞; 

2) 每隔一天更換一次培養液。當細胞匯合程度達 80%時,進行細胞傳代。將細胞培養液吸

出,用不含 Ca 2+和 Mg2+離子的 HBSS 小心清洗 2 次,加入 0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA 混

合消化液進行消化; 

3) 取細胞適量接種到 75 cm

2 培養瓶繼續培養或進行鋪板操作。 

2. Caco-2 細胞模型的構建及驗證 

1) 收集對數期的 Caco-2 細胞,用 MEM *培養液將細胞濃度調整為 2.0×10

5 cells/mL; 

2) 在 Transwell 板(聚碳酸酯膜,0.4 µm,1.12 cm 2)(圖 2)的基底側(Basolateral side)加

入 1.5 mLMEM *培養液,在頂側(Apical side)加入細胞懸液 0.5 mL; 

3) 放入細胞培養箱內培養,每兩天換一次培養液,培養一周后每日換液; 

4) 繼續培養至 21 天; 

5) 采用 Millicell ERS 電阻儀(Millipore 公司)測定跨上皮細胞電阻(大于 500 Ω•cm 2), 確定

細胞單層的致密性和完整性。 

3. 轉運研究 

下面以熒光標記的藥物為例,借助激光共聚焦顯微鏡來觀察藥物跨膜轉運(圖 3)。 

1) 取出 Transwell 板進行電阻測定,選擇符合轉運條件的細胞孔(電阻大于 500 Ω•cm 2)。 用

預熱(37℃)的 Hank’s 緩沖液洗 2~3 遍,并置 37℃孵育平衡 20~30 min,吸棄洗液; 

2) 分別取 0.5 mL 熒光標記的藥物溶液加入頂側(Apical side)作為供給液,同時基底側 (Basolateral side)加入 1.5 mL 空白 Hank’s 緩沖液作為接收液; 

3) 37℃條件下轉運 2 h; 

4) 轉運結束后移除孔內熒光液,加 HBSS 小心清洗 3 次,洗去未進入細胞的熒光染料結束轉 運;孔內加適量 4%多聚甲醛溶液,室溫下固定 20 min; 

5) 固定完成后用 HBSS 清洗 3 次,加 10 μg/mL Hoechst 33258 適量,室溫下染核 1 h;HBSS 清洗 3 次后,加 2 滴抗熒光淬滅劑,小心將單層細胞剪下至玻底小皿中,在激光共聚焦顯微 鏡下進行 Z 軸橫切,觀察熒光標記藥物的跨膜過程。 

由激光共聚焦顯微鏡拍攝的圖可以看出,帶綠色熒光的藥物A與帶紅色熒光的藥物B在Caco2 細胞模型中的跨膜轉運速率不同,其中藥物 A 的跨膜轉運速率慢于藥物 B,跨膜轉運速率 的不同與藥物本身的理化性質密切相關。 

除采用熒光標記的藥物進行跨膜轉運研究外,還可以采用非熒光標記的藥物進行跨膜研究,

此時測定藥物的跨膜轉運能力就需要借助其他檢測方式來(如高效液相色譜)完成。 

 

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