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基因定點突變

更新時間:2019-03-10瀏覽:1602次

一、定點突變的目的

把目的基因上面的一個堿基換成另外一個堿基。

二、定點突變的原理

通過設計引物,并利用 PCR 將模板擴增出來,然后去掉模板,剩下來的就是我們的 PCR

產物,在 PCR 產物上就已經把這個點變過來了,然后再轉化,篩選陽性克隆,再測序確定

就行了。

三、引物設計原則

引物設計的一般原則不再重復。

突變引物設計的特殊原則:

(1)通常引物長度為 25~45 bp,我們建議引物長度為 30~35 bp。一般都是以要突

變的堿基為中心,加上兩邊的一段序列,兩邊長度至少為 11-12 bp。若兩邊引物太短了,

很可能會造成突變實驗失敗,因為引物至少要 11-12 個 bp 才能與模板搭上,而這種突變

PCR 要求兩邊都能與引物搭上,所以兩邊盡量各設至少 12 個 bp,并且合成多一條反向互

補的引物。

(2)如果設定的引物長度為 30 bp,接下來需要計算引物的 Tm 值,看是否達到 78℃

(GC 含量應大于 40%)。

(3)如果 Tm 值低于 78℃,則適當改變引物的長度以使其 Tm 值達到 78℃(GC 含

量應大于 40%)。

(4)設計上下游引物時確保突變點在引物的中央位置。

(5)盡量使用經過純化的引物。

Tm 值計算公式:Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5 注:L:引物堿基數;% of GC:引物 GC 含量。

四、引物設計實例

GCG→ACG 為例:

5’-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3’

(1)首先設計 30 bp 長的上下游引物,并將 A (T)設計在引物的中央位置。

Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3’

Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3’

(2)引物GC含量為40%,

L為30,將這兩個數值帶入Tm值計算公式,得到其Tm=75.5

(Tm=0.41×40-675/30+81.5)。通過計算可以看出其 Tm 低于 78℃,這樣的引物是不合

適的,所以必須調整引物長度。

(3)重新調整引物長度。

Primer #1: 5’-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3’

Primer #2: 5’-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3’

在引物兩端加 5mer(斜體下劃線處),這樣引物的 GC 含量為 45.7%,L 值為 35,將

這兩個數值帶入 Tm 值計算公式,得到其 Tm 為 80.952(Tm=0.41×47.5-675/35+81.5),

這樣的引物就可以用于突變實驗了。

五、突變所用聚合酶及 Buffer

引物和質粒都準備好后,當然就是做 PCR 嘍,不過對于 PCR 的酶和 buffer,不能用平

時的,我們做 PCR 把整個質粒擴出來,延伸長度達到幾個 K,所以要用那些 GC buffer 或

擴增長片段的 buffer,另外,要用保真性能較好的 PFU 酶來擴增,防止引進新的突變。除了使用基因定點突變試劑盒,如 Stratagene 和塞百盛的試劑盒,但價格昂貴。可以

使用高保真的聚合酶,如博大泰克的金pai快速 taq 酶、Takara 的 PrimeSTARTM HS DNA

polymerase。

六、如何去掉 PCR 產物

zui簡單的方法就是用 DpnI 酶,DpnI 能夠識別甲基化位點并將其酶切,我們用的模板

一般都是雙鏈超螺旋質粒,從大腸桿菌里提出來的質粒一般都被甲基化保護起來(除非你用

的是甲基化缺陷型的菌株),而 PCR 產物都是沒有甲基化的,所以 DpnI 酶能夠特異性地切

割模板(質粒)而不會影響 PCR 產物,從而去掉模板留下 PCR 產物,所以提質粒時那些菌

株一定不能是甲基化缺陷株。

DpnI 處理的時間盡量長一點,少一個小時吧,盡量能有兩三個小時,因為如果模板

處理得不干凈,哪怕只有那么一點點,模板直接在平板上長出來,就會導致實驗失敗。

七、如何拿到質粒

直接把通過 DpnI 處理的 PCR 產物拿去做轉化就行了,然后再篩選出陽性克隆,并提

出質粒,拿去測序,驗證突變結果。

八、圖示九、定點突變操作步驟

[A] 誘導突變基因(PCR 反應)以待突變的質粒為模板,用設計的引物及 Muta-direct™

酶進行 PCR 擴增反應,誘導目的基因突變。

1. 設計點突變引物。

[注]參考引物設計指導

2. 準備模板質粒 DN A

[注]用 dam+型菌株(例如 DH5α 菌株)作為宿主菌。在 end+型菌株中常有克隆數低的現

象,但是對突變效率沒有影響。提取質粒 DNA 時我們建議您使用本公司的質粒提純試劑盒。

3. [選項]對照反應體系(50μl 反應體系)

10×Reaction Buffer

5μl

pUC18 control plasmid(10ng/μl,total

20ng)

2μlControl primer mix(20pmol/μl)

2μl

dNTP mixture(each 2.5mM)

2μl

dH2O

38μl

Muta-direct™ Enzyme

1μl

4. 樣品反應體系(50μl 反應體系)

10×Reaction Buffer

5μl

Sample plasmid(10ng/μl,total

20ng)

2μl

Sample primer (F)(10pmol/μl)

1μl

Sample primer (R)(10pmol/μl)

1μl

dNTP mixture(each 2.5mM)

2μl

dH2O

38μl

Muta-direct™ Enzyme

1μl

5. PCR 反應條件

[注]按如下參數設置 PCR 擴增條件。

Cycles

Temperature

Reaction Time

1cycle

95℃

30sec15cycle

95℃

30sec

55℃

1min

72℃

1min per plasmid Kb

6. PCR 擴增反應完成后冰育 5 分鐘,然后置于室溫(避免反復凍融)。

[注] 按下列提供的 PCR 條件進行擴增,控制 PCR 循環數。注意當突變點位點超過 4 個時

會發生突變率降低的現象。

Mutation

Cycles

1~2Nucleotide

15cycles

3Nucleotides

18cycles

[B] 突變質粒選擇

PCR 反應結束后使用 Mutazyme™酶消化甲基化質粒從而選擇突變質粒 DNA。

1. 準備 PCR 反應產物

2. 加入 1μl(10U/μl)Mutazyme™酶 37℃溫育 1 小時。

[注]當質粒 DNA 用量過多時 Mutazyme™酶可能發生與樣品反應不*的現象。因此我們

建議為了保證突變率請嚴格遵照實驗步驟進行操作。如果突變率低,可以適當延長反應時間

或增加 Mutazyme™酶用量。

[C]轉化

反應完畢后在質粒 DNA 上會產生缺口,當把這個質粒 DNA 轉入 E.coli 中時請選擇 dam+

型菌株,例如 DH5α。

1. 將 10μl 樣品加到 50μl 感受態細胞里,然后放置在冰上 30 分鐘。

2. 接下來可以參照一般的轉化步驟進行。序列分析

通常當 LB 平板上出白色菌落則表明發生了突變。

 

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