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動物基因組 DNA 的提取

更新時間:2019-03-10瀏覽:1320次

動物基因組 DNA 的提取

[實驗原理]

在 EDTA 和 SDS 等去污劑存在下,用蛋白酶 K 消化細胞,隨后用酚抽提,可以得到哺乳

動構基因組 DNA,用此方法得到的 DNA 長度為 100-150 kb,適用于 L 嘴菌體構建基因組

文庫和 Southern 分析。

通過本實驗了解并掌握提取基因組 DNA 的原理和步驟,以及相對分子質量較大的 DNA

的 瓊脂糖凝膠電泳技術。

[儀器、材料與試劑]

(一)儀器

1.臺式離心機

2.玻璃勻漿器

3.高壓滅菌鍋

4.恒溫水浴

(二)材料

1.1.5mL 微量離心管

2.微量取樣器和吸頭

3.無菌過濾器(一次性)

4.10 mL 注射器

5.鼠肝

6.三羥甲基氨基甲烷(Tris)

7.十二烷基硫酸鈉(SDS)

8.乙二胺四乙酸(EDTA)9.蛋白酶 K

10.RNA 酶

11.DNA 相對分子質量標準物,DNA/EcoRI+HindⅢ相對分子質量標準物

(三)試劑

1、1.5 mol/L NaCl

2、0.5 mol/L Tris·HCI pH8.0

3.0.5 mol/L EDTA pH8.0

4.3 mol/L NaAc pH5.2

以上均高壓滅菌。

5.蛋白酶 K 10mg/mL 配好后用一次性過濾器過濾,-20 保存(教師配制)

6.組織勻漿液 100mmol/LNaCI,10mmol/LTris·HCl(pH 8.0),0.25mmol/

LEDTA(pH8.0)

7.酶解液 200mmol/LNaCI,20mmol/L Tris·HCI(pH 8.O),50mmol/LEDTA(PH

8.0),200~g/mL 蛋白酶 K,1%SDS

8.無 DNA 酵的 RNA 酶 : 將胰 RNA 酶溶解于 10mmol/L Tris.HCI(pH7.5)、15 mmol

/L NaCl 溶液中,濃度 l0mg/mL,于 100℃水浴處理 15min,以降解 DNA 酶,緩慢冷

卻到室溫,-20℃保存

9.TE 緩沖液 :10mmol/LTris·HCl(pH8.0),25 mmol/LEDTA(pH8.0)

10.平衡酚(pH8.0):氧仿:異戊醇=25:24:1<體積比)

11.氧仿:異戊醇=24:l(體積比)

12.5xTBE 5.4gTris,2.75g 硼酸 2mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0),加水到 100mL;

13.6x 上樣緩沖液 o.25%溴酚藍,40%(W/V)蔗糖水溶液14.λDNA/EcoRI+/HindⅢ 相對分于質量標準物片段(bP)21 227,5148,4 973,4 268,

3 530,2 027,1 904,1 584,1 315,947,831,564,125

[實驗步驟]

本實驗在無液氮的條件下,鍘備鼠肝 DNA,與有液氮條件下相比,產量和質量都有所下

降。整個操作過程中,應盡量避免 DNA 酶的污染,特 g4 注童動作溫和,減少對 DNA 的

機械捌傷。

1、取 0.2g 鼠肝,用冰冷的生理鹽水洗 3 次,然后置于 2.0mL 勻漿掖中,用玻璃勻漿器勻

漿至無明顯組織塊存在(冰浴操作,切匆將細胞破碎,可鏡檢觀察)。

2、將組織細胞移至 1.5ml 離心管中,50000rpm 離心 30-60sec,(盡可能在低溫下操作),

棄上清,若沉淀中血細胞較多,可再加入 1 倍于細胞體積的勻漿液洗一次。

3、沉淀加 0.8mL 無菌水迅速吹散,分兩管,再加 0.4mL 酵解液,翻轉混勻(動作一定要

輕)55℃水浴處理 12-18 h;

4、沉淀加 RNase 至終濃度 200µg/mL,37℃水浴 1 h;

5、加入等體積酚/lv仿/異戊醇抽提一次,(慢慢旋轉混勾,傾斜使兩相接觸面增大)。4℃、

10min、10000rpm 離心;

6、有時如果 DNA 含量過高,水相在下層,實驗時應注意觀察。用擴口吸頭移出含 DNA

的水相(注意勿吸出界面中蛋白沉淀),加等體積氧仿/異戊醇,4℃、

10 000rrpm 離心 10rain (若界面或水相中蛋白含量多,可重復 1.6 操作)。

7、用擴口吸頭小心吸出上層含 DNA 的水相,加 1/10 體積的 NaAc,小心混勻(要充分),

再向每管中加入 2.5 倍體積的無水乙醇,-20 過夜。8、12 000rpm 離心 19min,棄上清,75%冷乙醇洗滌一次,12000rpm 離心 15min 室

握溫干燥(不要大干,否則 DNA 不易溶解),加入適量 TE 緩沖液,存放于 4℃,輕搖溶解過

夜,即可得 到實驗動物基因組 DNA。

9、電泳鑒定 DNA,由于基因組 DNA 相對分子質量較大,用 0.3%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定,

先在底部錦一層 1%的支持膠,凝固后再鋪上一層 0.3%瓊脂糖凝膠,插上梳子(枚子不能瑾

到的支持膠)。取 1.5µL 溶解的 DNA、1µL 上樣緩沖液和 35µl 無菌水混勻后小心上樣(可在

另一孔加 DNA 相對分于質量標準),觀察基因組 DNA 大小,用溴化乙錠染色觀察結果。

[注意事項]

1、操作過程盡量在低溫下進行,避免 DNA 降解。

2、瓊脂糖凝膠脆弱,應小心操作。

3、提取得到的基因組 DNA 應為單一條帶,DNA 降解可形成彌散帶型。

 

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