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SSR 分子標記實驗操作及其注意事項

更新時間:2019-03-10瀏覽:2700次

SSR(Simple Sequence Repeats ) 又稱微衛星 DNA,是一類由幾個(多為 1~6 個) 堿基組成的基序

(motif )串聯重復而成的 DNA 序列,其長度一般較短,它們廣泛分布于整個基因組的不同位置上,每個座

位上重復單位的數目及重復單位的序列都可能不*相同,因而造成了每個座位上的多態性。SSR 標記數

量豐富,覆蓋整個基因組,而且分布均勻,多態性高,呈共顯性遺傳,重復性好,操作簡便,是一種理想

的分子標記技術,被廣泛應用于構建基因連鎖圖分子輔助育種品種鑒定遺傳資源的保存等方面。

一、試劑配制

1.0.2%親水 binding silence(現配現用):1500μL95%乙醇,7.5μL 冰醋酸,再加入 3μLbinding silence,

混勻后使用。

2.0.5%疏水 repel silence(購買后可直接使用)

3.TBE 母液(5×TBE):Tris Base,54g;硼酸,7.5g;EDTA(0.5M pH8.0),20ml.攪拌溶化,定容至 1000ml,

無需滅菌,室溫保存,母液的 pH 值應保持在 8.3 左右。

4.Urea-TBE(一塊膠板用量): 5×TBE,12ml;尿素,27g.加雙蒸水溶解后定容至 51ml,使用漏斗過濾。

5.40%丙烯酰胺:丙烯酰胺,380g;甲叉雙丙烯酰胺,20g.加熱至 37℃使之溶解,加水定容至 1000ml,用

醋酸纖維素濾膜(入 Nalge 濾器,0.45μm 孔徑)過濾,棕色瓶避光保存于室溫。

6.10%APS(過硫酸銨):超純過硫酸銨,2g;超純水,18ml.溶解后,4℃保存。

7.TEMED(購買后可直接使用):電泳級的 TEMED 可購自 Bio-Rad,Sigma 或其他供應商。

8.Loading buffer:去離子甲酰胺,50ml;0.5MEDTA(pH8.0),1ml;二甲苯腈藍 cyanol,0.125g;溴酚

藍,0.125g.混勻后置于 4℃保存。

9.固定液:無水乙醇 50ml,冰醋酸 2.5ml,水 447.5ml。配制成終濃度為 10% 乙醇,0.5% 冰醋酸的

固定液。

10.染色溶液(ACS 試劑):無水乙醇 50ml,冰醋酸 2.5ml,水 447.5ml,AgNO3 1g。配制成終濃度為10% 乙醇,0.5% 冰醋酸,0.2% AgNO3的染色液。

11.顯影溶液:15g NaOH,0.5ml 甲醛,水 500ml。終濃度為 3%NaOH,0.1%甲醛。

二:DNA 提取過程中的注意事項

(1) 避免試驗材料間 DNA 的交叉污染或外來 DNA 的污染。使用冷凍干燥葉片法,可以將每個樣品在單

獨的離心管中研磨,研磨使用的小鋼珠球是一次性的,如果是反復使用的小鋼珠球,必須*清洗干

凈使用液氮和研缽研磨葉片組織時,必須在每次研磨前*清理干凈研缽和研磨棒。

(2) 試驗材料應選取幼嫩組織,因為植物幼嫩組織 DNA 含量高,且多糖多酚含量少。

(3) 裝入離心管的葉片組織盡量不要超過離心管的 1/3-1/2,否則會引起細胞裂解不*,導致產量和純

度下降。

(4) 使用液氮研磨時,要先將研缽用液氮冷卻,在加入液氮后,要先將葉片壓碎,研磨時要快速用力,盡

量使樣品磨成粉末狀。

(5) 水浴前需要確保試管蓋蓋嚴,或使用輔助工具進行加固,以防止水浴時因溫度較高導致試管蓋開裂。

(6) 水浴過程中,每隔 10-15min 將離心管取出振蕩搖勻,使粉碎的葉片組織盡量與裂解液充分接觸,破

壞細胞結構,釋放 DNA。

(7) 實驗過程中振蕩動作不宜劇烈,移液槍頭使用大孔槍頭,移液動作不能太快,以免使 DNA 斷裂。

(8) 當 DNA 以小球狀固體沉積在離心管底部后,傾倒離心管中多余液體時,應避免把 DNA 小球一起倒

出 可在倒去大部分液體后,改用吸水紙吸取剩余液體。

(9) DNA 風干在無菌操作臺上進行,待乙醇*風干后才能加入 TE 或 ddH2O 溶解,如果有殘留的

乙醇,可能會影響 PCR 反應的試驗結果。

(10) 如果 DNA 純度不好,可將粗提物用溶液 1×TE 充分溶解,離心后,取上清液再次沉淀 DNA,可有

效除去多糖。

三:實驗步驟1、玻璃板清洗:

1)用洗滌劑把玻璃反復擦洗干凈,用酒精擦干、干燥。在疏水玻璃板上均勻涂上 300-500μL 的 0.5%的

疏水劑 Binding Silane。可放置過夜。

2)配制凝膠前,在親水玻璃板上均勻涂上 2%的親水劑 Repel Silane,保證玻璃板的每個地方都涂上親

水劑,晾干至少 5min,然后用酒精輕輕擦拭以去掉多余的親水劑。

3)玻璃板*干燥后進行玻璃板組裝。兩塊玻璃板兩邊邊緣割傷配套的硬紙條,橡皮夾子夾住兩邊,在

橡皮夾子里加上硬紙片可以保證玻璃板的水平,可以有效地防止條帶跑歪。下邊套上有旋鈕的塑料套,旋

緊旋鈕,以防止底下漏膠在插入梳子的位置插入一個硬紙條以保證上方凝膠界面水平且整齊。

4)將裝好的玻璃板水平放置于桌面上,親水玻璃板至于下面,而帶電極的疏水玻璃板朝上,保證玻璃板

的水平。

2、聚丙烯酰胺凝膠的制備

1)每一塊膠的用量配制如下:(大膠)

Urea-TBE 51ml

40%丙烯酰胺 9ml

10%APS 400μl

TEMED 30μl

共計 約 60ml

2)迅速輕輕搖勻,注意不要用力攪拌,混勻后立即灌膠。

3)將混合液導入大注射器中,將導管中氣泡擠出,迅速將導管口插入灌膠口,在重力作用下,混合液流

入兩塊玻璃板之間,人為控制流速以防止氣泡產生。

4)灌膠完成后,聚合時間至少在 1 小時,若凝膠要放置過夜,則須在凝膠兩頭鋪上濕濾紙(以 1×TBE

浸濕)以防止凝膠變干。4℃保存,凝膠使用之前可保存 1-2 天。3、凝膠電泳

1)正極槽(底下)中加入 600ml 的 1×TBE 緩沖液,組裝上配好凝膠的玻璃板,拔去維持凝膠上方水平

的硬紙條,負極槽上加入 800ml 的 0.5×TBE 緩沖液直至覆蓋了凝膠上方。

2)將凝膠上方多余的膠用槍沖洗干凈,并將氣泡清除。

3)預電泳 30min,保持在恒定功率 55W(相當于電壓 1441V,電流 38mA)。

4)預電泳完成后,關閉電源,用槍將凝膠上方多余的氣泡和膠清除干凈,插入梳子,再用槍將梳子中的

氣泡清除干凈。

5)加入 3μl 已由 loading buffer 處理過的樣品 DNA,每塊板子可點 1-3 個 Marker,55W 恒定功率電

泳 1.5h,至DI一條 Loading buffer 指示帶(二甲苯青帶,約相當于 260bp 雙鏈 DNA)跑至膠板的 2/3

處(距底部 1/3 處)時停止電泳。

6)通過帶電極玻璃板中部的出水孔排出 0.5×TBE 緩沖液,剩余的 0.5×TBE 緩沖液直接倒掉,緩沖液可

反復使用幾次。

7)小心的分開兩塊玻璃板,這時凝膠會粘連在涂有親水劑的玻璃板上。

4、銀染

1)將帶凝膠的玻璃板浸在固定液(10% 乙醇,0.5% 冰醋酸)中 20min,凝膠朝下放置,玻璃板位于

上方。

2)將玻璃板取出,浸在染色液(10% 乙醇,0.5% 冰醋酸,0.2% AgNO3 (ACS 試劑))中 15min,

凝膠朝下放置,玻璃板位于上方。

3)用自來水(盡量用雙蒸水)短時間(5-10s)沖洗玻璃板兩面,玻璃板須離水近些,否則凝膠容易變

黑。

4)將凝膠浸在顯影液(3%NaOH,0.1%甲醛)中,顯影 20-30min,直至帶紋出現。凝膠朝上放置。

5)用自來水(盡量用雙蒸水)沖洗凝膠兩遍,每次 2min。6)室溫下自然干燥,干燥后的膠板覆蓋保鮮膜,可以保存,也可以進行拍照記錄。

四、PCR 反應

1、模板及引物配制

1)模板 DNA:使用 25ng/μl 的 DNA 作為模板。

2)引物:母液 250M,取 10μl 的母液加水至 100μl 即得到 25μM 的引物。

2、DNA pian段擴增:

取 2uL 烯釋的模板 DNA(25ng/uL)加入 18uL 如下的反應液:

H2O 13.5

10×buffer 2

dNTPs(10mM) 0.4

引物Ⅰ(25uM) 0.4

引物Ⅱ(25uM) 0.4

MgCL2(1.5mM) 1.2

Taq 酶(5U/uL) 0.1

Total 18

混合后按如下 PCR 程序擴增:

Step1 95℃ 9M;

Step2 94℃ 50S;

Step3 退火溫度 45S;

Step4 72℃ 90S;

Srep5 Go to Step2,repeat 27 cycles;

Step6 72℃ 7M。擴增后的樣品中加入 3/4 體積的 Loading Buffer,混合,95℃變性,待用。

五:PCR 反應實驗操作注意事項

PCR 反應過程中應特別注意不要使樣品相互污染, 以免造成試驗結果不準確, 同時也要注意所加試

劑或樣品必須是經過混勻后的液體, 這樣才能保證反應液各成分的濃度和體積的均一性 所用試劑需從正

規商家購進, 以保證試劑的質量。

( 1) 盡量使用一次性手套 整套移液器 成套試劑和其他必需品,

避免外來 DNA 污染反應體系( 2)

DNA 模板應稀釋為適宜的濃度, 使加入 PCR 反應的 DNA 樣品體積盡量在 4 ~ 5 l 如果 DNA 模板

樣品量太少, 僅有 1 ~ 2 l, 不僅實驗操作難度大, 而且如果操作時間長, 會導致 DNA 反應液部分

或全部蒸發掉, 影響 PCR 反應結果。

( 3) 可以先將 DNA 樣品加到 PCR 管底部, 再加其他 PCR 反應混合液 加樣時選擇不同的方位加

DNA 模板和其他 PCR 反應混合液, 這樣槍頭靠壁加樣時不會交叉污染。

( 4) 加樣完畢后,

蓋上蓋子,

混勻反應液,

再低速離心片刻( 1 min 左右) 如果不是立即進行 PCR 擴

增, 需將 PCR 反應混合液置于 - 20 ℃保存備用。

( 5) PCR 擴增反應使用的酶不能長時間放置于室溫下, 須隨用隨取, 使用完畢后立即放回 - 20 ℃

冰箱否則, 酶易失活。

( 6) PCR 反應的退火溫度應根據不同的引物來確定退火溫度, 以確保擴增的條帶中雜帶少, 目標

帶明顯, 引物退火溫度一般按照 Tm = 4 ℃( G + C) + 2 ℃( A + T) 公式計算。

 

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