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DNA的瓊脂糖凝膠電泳

更新時間:2019-03-09瀏覽:1669次

                                                    DNA的瓊脂糖凝膠電泳

 

實驗目的

瓊脂糖凝膠電泳是常用的檢測核酸的方法,具有操作方便、經濟快速等優點。本實驗學習

DNA瓊脂糖凝膠電泳的使用技術,掌握有關的技術和識讀電泳圖譜的方法。

實驗原理

   瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定DNARNA分子混合物的方法,這種電泳方

法以瓊脂凝膠作為支持物,利用DNA分子在泳動時的電荷效應和分子篩效應,達到分離混

合物的目的。DNA分子在高于其等電點的溶液中帶負電,在電場中向陽極移動。在一定的

電場強度下,DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應,即分子本身的大小和構型是主要的

影響因素。DNA分子的遷移速度與其相對分子量成反比。不同構型的DNA分子的遷移速

度不同。如環形DNA分子樣品,其中有三種構型的分子:共價閉合環狀的超螺旋分子

cccDNA)、開環分子(ocDNA)、和線形DNA分子(IDNA)。這三種不同構型分子進行電

泳時的遷移速度大小順序為:cccDNAIDNAocDNA

    核酸分子是兩性解離分子,pH3.5是堿基上的氨基解離,而三個磷酸基團中只有一個磷

酸解離,所以分子帶正電,在電場中向負極泳動;而pH8.0-8.3時,堿基幾乎不解離,而

磷酸基團解離,所以核酸分子帶負電,在電場中向正極泳動。不同的核酸分子的電荷密度大

致相同,因此對泳動速度影響不大。在中性或堿性時,單鏈DNA與等長的雙鏈DNA的泳

動率大致相同。

影響核酸分子泳動率的因素主要是:

1、樣品的物理性狀

 

 

 

即分子的大小、電荷數、顆粒形狀和空間構型。一般而言,電荷密度愈大,泳動率越大。但

是不同核酸分子的電荷密度大致相同,所以對泳動率的影響不明顯。

對線形分子來說,分子量的常用對數與泳動率成反比,用此標準樣品電泳并測定其泳動率,

然后進行DNA分子長度(bp)的負對數——泳動距離作標準曲線圖,可以用于測定未知

分子的長度大小。

DNA分子的空間構型對泳動率的影響很大,比如質粒分子,泳動率的大小順序為:cDNA

IDNAocDNA但是由于瓊脂糖濃度、電場強度、離子強度和溴化乙錠等的影響,會出

現相反的情況。

2、支持物介質

核酸電泳通常使用瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠兩種介質,瓊脂糖是一種聚合鏈線性分子。

含有不同濃度的瓊脂糖的凝膠構成的分子篩的網孔大小不同,是于分離不同濃度范圍的核酸

分子。聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺(Acr)在 N,N,N-四甲基乙四胺(TEMED)和過硫酸銨

AP)的催化下聚合形成長鏈,并通過交聯劑N,N-亞甲雙丙烯酰胺(Bis)交叉連接而成,

其網孔的大小由AcrBis的相對比例決定。

瓊脂糖凝膠適合分離長度10060的分子,而聚丙烯酰胺凝膠對于小片段(5bp-500bp

的分離效果好。選擇不同濃度的凝膠,可以分離不同大小范圍的DNA分子。

3、電場強度

電場強度愈大,帶點顆粒的泳動越快。但凝膠的有效分離范圍隨著電壓增大而減小,所以電

泳時一般采用低電壓,不超過4V/cm。而對于大片段電泳,甚至用0.5-1.0V/cm電泳過夜。

進行高壓電泳時,只能使用聚丙烯酰胺凝膠。

4、緩沖液離子強度

 

 

 

核酸電泳常采用TAETBETPE三種緩沖系統,但它們各有利弊。TAE價格低廉,但緩沖

能力低,必須進行兩極緩沖液的循環。TPE在進行DNA回收時,會使DNA污染磷酸鹽,

影響后續反應。所以多采用TBE緩沖液。

在緩沖液中加入EDTA,可以鰲合二價離子,抑制DNase,保護DNA

緩沖液pH常偏堿性或中性,此時核酸分子帶負電,向正極移動。

核酸電泳中常用的染色劑是溴化乙錠(ethidium bromide EB)。溴化乙錠是一種扁平分

子,可以嵌入核酸雙鏈的配對堿基之間。在紫外線照射BE-DNA復合物時,出現不同的效

應。254nm的紫外線照射時,靈敏度高,但對DNA損傷嚴重;360nm紫外線照射時,

雖然靈敏度較低,但對DNA損傷小,所以適合對DNA樣品的觀察和回收等操作。300nm

紫外線照射的靈敏度較高,且對DNA損傷不是很大,所以也比較適用。

使用溴化乙錠對DNA樣品進行染色,可以在凝膠中加入終濃度為0.5μg/mlEBEB

DNA分子中,可以在電泳過程中隨時觀察核酸的遷移情況,但是如果要測定核酸分子大

小時,不宜使用以上方法,而是應該在電泳結束后,把凝膠浸泡在含0.5μg/mlEB的溶液中

1030min進行染色。BE見光分解,應在避光條件下4℃保存。

材料、試劑及器具

1、材料

1kbMarker(分子量標準);DNA樣品

2、試劑

加樣緩沖液(6x):0.25%溴酚蘭,40%蔗糖;瓊脂糖;溴化乙錠(EB);酶液(10mg/ml)。

 

3、器具

1)電泳系統:電泳儀、水平電泳槽、制膠板等。

2)紫外透射儀。

 

 

 

操作步驟

1、按所分離的DNA分子的大小范圍,稱取適量的瓊脂糖粉末,放到一錐形瓶中,加入適

量的0.5×TBE電泳緩沖液。然后置微波爐加熱至*溶化,溶液透明。稍搖勻,得膠液。

冷卻至60℃左右,在膠液內加入適量的溴化乙錠至濃度為0.5μg/ml 

2、取有機玻璃制膠板槽,有透明膠帶沿膠槽四周封嚴,并滴加少量的膠液封好膠帶與膠槽

之間的縫隙。

3、水平放置膠槽,在一端插好梳子,在槽內緩慢倒入已冷至60℃左右的膠液,使之形成均

勻水平的膠面。

4.待膠凝固后,小心拔起梳子,撕下透明膠帶,使加樣孔端置陰極段放進電泳槽內。

5、在槽內加入0.5×TBE電泳緩沖液,至液面覆蓋過膠面

6、把待檢測的樣品,按以下量在潔凈載玻片上小心混勻,用移液槍加至凝膠的加樣孔中。

1μl加樣緩沖液(6×)+5μl待測DNA樣品

+0.5μlEB液(10mg/ml)(注:若膠內未加EB,可選用此法)。〕

7、接通電泳儀和電泳槽,并接通電源,調節穩壓輸出,電壓高不超過5V/cm,開始電泳。

點樣端放陰。根據經驗調節電壓使分帶清晰。

8、觀察溴酚蘭的帶(藍色)的移動。當其移動至距膠板前沿約1cm處,可停止電泳。

9、染色:把膠槽取出,小心滑出膠塊,水平放置于一張保鮮膜或其他支持物上,放進EB

溶液中進行染色,*浸泡約30min

10、在紫外透視儀的樣品臺上重新鋪上一張保鮮膜,趕去氣泡平鋪,然后把已染色的凝膠

放在上面。關上樣品室外門,打開紫外燈(360nm254nm),通過觀察孔進行觀察。

注意事項

 

 

 

1、電泳中使用的溴化乙錠(EB)為中度毒性、強致癌性物質,務必小心,勿沾染于衣物、

皮膚、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在專門的電泳區域操作,戴一次性手套,并及時更換。

 

2、預先加入EB時可能使DNA的泳動速度下降15%左右,而且對不同構型的DNA的影

響程度不同。所以為取得較真實的電泳結果可以在電泳結束后再用0.5μg/mlEB溶液浸

泡染色。若膠內或樣品內已加EB,染色步驟可省略;若凝膠放置一段時間后才觀察,即使

原來膠內或樣品已加EB,也建議增加此步。

3、加樣進膠時不要形成氣泡,需在凝膠液未凝固之前及時清除,否則,需重新制膠。

4、以 0.5×TBE作為電泳緩沖液時,溴酚蘭在0.5%1.4%的瓊脂糖凝膠中的泳動速度大約

相當于300bp的線性DNA的泳動速度,而二甲苯青FF的泳動速度相當于4Kb的雙鏈線

DNA的泳動速度。

 

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