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cDNA文庫構建

更新時間:2019-03-09瀏覽:1178次

cDNA文庫構建 

(字體說明:FANG-仿,DI-,suan- )

cDNA文庫

[原理]

cDNA文庫不同于基因組文庫,被克隆DNA是從mRNA反轉錄來源的DNACDNA

組成特點是其中不含有內含子和其他調控序列。從而做cDNA克隆時應是先從獲得mRNA

開始,在此基礎上,通過反轉錄酶作用產生一條與 mRNA 相互補的 DNA 鏈,然后除掉

mRNA,以DI一條DNA鏈為模板復制出DI二條DNA鏈(雙鏈);再進一步把此雙鏈插入

原核或真核載體。

 

      cDNA文庫的構建

分為六個階段:

階段1:反轉錄酶催化合成cDNADI一鏈

階段2cDNADI二鏈的合成

階段3cDNA的甲基化

階段4:接頭或銜接子的連接

階段5Sepharose CL-4B凝膠過濾法分離cDNA

階段6cDNA與λ噬菌體臂的連接

 

[階段1:反轉錄酶催化合成cDNADI一鏈]

1.在置于冰上的無菌微量離心管內混合下列試劑進行cDNADI一鏈的合成:

poly(A)+RNA (1μg/μl)                         10μl

寡核苷suan引物(1μg/μl)                          1μl

1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37)                    2.5μl

1mol/L KCl                                    3.5μl

250 mmol/L MgCl2                               2μl

dNTP溶液(含4dNTP,每種5mmol/L        10μl

0.1 mol/L DTT                                   2μl

RNase抑制劑(選用)                          25單位

H2O                                      48μl

2.當所有反應組在 0℃混合后,取出 2.5μl 反應液轉移到另一個 0.5ml 微量離心管內。在

這個小規模反應管中加入0.1μl [α-32P] dCTP400 Ci/mmol, 10mCi/ml)。

3.大規模和小規模反應管都在37℃溫育1h

4.溫育接近結束時,在含有同位素的小規模反應管中加入1μl 0.25mol/L EDTA,然后將

反應管轉移到冰上。大規模反應管則在70℃溫育10 min,然后轉移至冰上。

5.參考《分子克隆實驗指南》DI三版附錄8所述方法,測定0.5μl小規模反應物中放射性

總活度和可被三氯乙suanTCA)沉淀的放射性活度。此外,用合適的 DNA 分子質量參

照物通過堿性瓊脂糖凝膠電泳對小規模反應產物進行分析是值得的。

6.按下述方法計算cDNADI一鏈的合成量(推算方法略):

    [摻入的活度值(cpm)/總活度值]×66(μg)=合成的 cDNADI一鏈(μg)

7.盡可能快地進行cDNA合成的下一步驟。

 

[階段2cDNADI二鏈的合成]

1.將下列試劑直接加入大規模DI一鏈反應混合物中:

10 mmol/L MgCl2                                70μl

2 mol/L Tris-HCl (pH7.4)                           5μl

10 mCi/ml[α-32P] dCTP400 Ci/mmol            10μl

1 mol/L (NH4)2SO4                               1.5μl

RNase H (1000單位/ml)                            1μl

大腸桿菌DNA聚合酶I (10 000單位/ml)            4.5μl

溫和振蕩將上述試劑混合,在微量離心機稍離心,以除去所有氣泡。在16℃溫育2~4h

2.溫育結束,將下列試劑加到反應混合物中:

β-NAD (50 mmol/L)                               1μl

大腸桿菌DNA連接酶(1000~4000單位/ml)            1μl

室溫溫育15min

3.溫育結束,加入1μl含有4dNTP的混合物和2μl T4噬菌體DNA聚合酶。反應混合

物室溫溫育15分鐘。

4.取出3μl反應物,按步驟78描述的方法測定DI二鏈DNA的質量。

5.將5μl 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)加入剩余的反應物中,用酚:氯FANG和氯FANG分別抽提混合

物一次。在 0.3 mol/L(pH5.2)suan鈉存在下,通過乙醇沉淀回收 DNA,將 DNA 溶解

90μl TE(pH7.6)溶液中。

6.將下列試劑加到DNA溶液中:

10×T4多核苷suan激酶緩沖液                10μl

T4多核苷suan激酶(3000單位/ml            1μl

室溫溫育15分鐘。

7.測定從上面步驟4取出的3μl反應物中放射性活度,并按分子克隆實驗指南》DI三版附

8所述方法測定1μlDI二鏈合成產物中能被三氯乙suan沉淀的放射性活度。

8.用下面公式計算DI二鏈反應中所合成的cDNA量。要考慮到已摻入到DNADI一鏈種的

dNTP的量。

[DI二鏈反應中所摻入的活度值(cpm)/總活度值(cpm)]*(66μg -xμg)=cDNA DI二鏈合

成量/μg

x表示cDNADI一鏈量。CDNADI二鏈合成量通常為DI一鏈量的70~80%

9.用等量酚:氯FANG對含有磷suancDNA(來自步驟6)的反應物進行抽提。

10  Sephadex G-50用含有10 mmol/L NaClTE(pH7.6)溶液進行平衡,然后通過離

子柱層析將未摻入的dNTPcDNA分開。

11  加入0.1倍體積的3mol/Lsuan鈉(pH5.2)和 2倍體積的乙醇,沉淀柱層析洗脫下

來的 cDNA,將樣品置于冰上至少 15 分鐘,然后在微量離心機上以高速度 4℃離心

15分鐘,回收沉淀DNA。用手提微型監測儀檢查,是否所有放射性都沉淀下來。

12  70%乙醇洗滌沉淀物,重復離心。

13  小心吸出所有液體,空氣干燥沉淀物。

14  如果需要用

Eco R I甲基化酶對cDNA進行甲基化,可將cDNA溶解于80μl TE(pH7.6)

溶液中。另外,如果要將cDNA直接與

Not I

Sal I接頭或寡核苷suan銜接子相連,可

cDNA懸浮在 29μl TE(pH7.6)溶液。沉淀的DNA重新溶解后,盡快進行cDNA

成的下一步驟。

 

[階段3cDNA的甲基化]

1.在cDNA樣品中加入以下試劑:

2 mol/L Tris-HCl (pH8.0)                      5μl

5 mol/L NaCl                                2μl

0.5 mol/L EDTA(pH8.0)                       2μl

20 mmol/L S-腺苷甲硫氨suan                    1μl

H2O                                  96μl

2.取出兩小份樣品(各2μl)至0.5ml微量離心管中,分別編為1號和2號,置于冰上。

3.在余下的反應混合液中加入2μl Eco R I 甲基化酶(80 000單位/ml),保存在0℃直至

步驟4完成。

4.再從大體積的反應液中吸出另外兩小分樣品(各 2μl)至 0.5ml 微量離心管中,分別編

3號和4號。

5.在所有四小份樣品(來自步驟2和步驟4)加入100 ng質粒DNA500 ng的λ噬菌

DNA。這些未甲基化的DNA在預實驗中用作底物以測定甲基化效率。

6.所有四份小樣實驗反應和大體積的反應均在37℃溫育1h

7.于68℃加熱15min,用酚:氯FANG抽提大體積反應液一次,再用氯FANG抽提一次。

8.在大體積反應液中加入0.1倍體積的3 mol/Lsuan鈉(pH5.2)和2倍體積的乙醇,混

勻后貯存于-20℃直至獲得小樣反應結果。

9.按下述方法分析4個小樣對照反應:

a.     在每一對照反應中分別加入:

0.1 mol/L MgCl2                      2μl

10× Eco R I 緩沖液                    2μl

H2O                           20μl

b.     2號和4號反應管中分別加入20單位

Eco R I

c.     四個對照樣品于37℃溫育1h,通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析。

10  微量離心機以高速離心15min(4)以回收沉淀cDNA。棄上清,加入200μl 70%

乙醇洗滌沉淀,重復離心。

11  用手提式微型探測器檢查是否所有放射性物質均被沉淀。小心吸出乙醇,在空氣中晾

干沉淀,然后將DNA溶于29μl TEpH8.0)。

12  盡可能快地進行cDNA合成的下一階段。

 [階段4:接頭或銜接子的連接]

cDNA末端的削平

1cDNA樣品于68℃加熱5 min

2.將cDNA溶液冷卻至37℃并加入下列試劑:

5×T4噬菌體DNA聚合酶修復緩沖液    10μl

dNTP溶液,每種5 mmol/L               5μl

H2O                             50μl

3.加入1~2單位T4 噬菌體 DNA聚合酶(500單位/ml),37℃溫育15min

4.加入1μl 0.5mol/L EDTA(pH8.0),以終止反應。

5.用酚:氯FANG抽提,再通過Sephadex G-50離心柱層析,除去未摻入的dNTP

6.在柱流出液中加入0.1倍體積的3 mol/L suan鈉(pH5.2)和二倍體積的乙醇,樣品于

4℃至少放置15 min

7.在微量離心機上以高速離心15 min(4),回收沉淀的cDNA。沉淀經空氣干燥后

溶于13μl10 mmol/L Tris-HCl (pH8.0).

 

接頭-銜接子與cDNA的連接

8.將下列試劑加入到已削成平末端的DNA中:

10×T4噬菌體DNA聚合酶修復緩沖液       2μl

800~1000 ng的磷suan化接頭或銜接子          2μl

T4噬菌體DNA連接酶(105 Weiss單位/ml  1μl

10 mmol/L ATP                             2μl

混勻后,在16℃溫育 8~12h

9.從反應液中吸出0.5μl貯存于4℃,其余反應液于68℃加熱15min以滅活連接酶。

[階段5Sepharose CL-4B凝膠過濾法分離cDNA]

Sepharose CL-4B柱的制備

1.用帶有彎頭的皮下注射針頭將棉拭的一半推進1ml滅菌吸管端部,用無菌剪刀剪去露在

吸管外的棉花并棄去,再用濾過的壓縮空氣將余下的棉拭子吹至吸管狹窄端。

2.將一段無菌的聚氯乙烯軟管與吸管窄端相連,將吸管寬端浸于含有0.1 mol/L NaCl

TEpH7.6)溶液中。將聚氯乙烯管與相連于真空裝置的錐瓶相接。輕緩抽吸,直至吸

管內充滿緩沖液,用止血鉗關閉軟管。

3.在吸管寬端接一段乙烯泡沫管,讓糊狀物靜置數分鐘,放開止血鉗,當緩沖液從吸管滴

落時,層析柱亦隨之形成。如有必要,可加入更多的 Sepharose CL-4B,直至填充基

質幾乎充滿吸管為止。

4.將幾倍柱床體積的含0.1 mol/L氯化鈉的TE(pH7.6)洗滌柱子。洗柱完成后,關閉柱子

底部的軟管。

 

依據大小分離回收DNA

5.用巴斯德吸管吸去柱中Sepharose CL-4B上層的液體,將cDNA加到柱上(體積50μl

或更小),放開止血鉗,使cDNA進入凝膠。用50μl TE(pH7.6)洗滌盛裝cDNA的微

量離心管,將洗液亦加于柱上。用含0.1 mol/L NaClTE(pH7.6)充滿泡沫管。

6.用手提式小型探測器監測 cDNA 流經柱子的進程。放射性 cDNA 流到柱長 2/3 時,開

始用微量離心管收集,每管2滴,直至將所有放射性洗脫出柱為止。

7.用切侖科夫計數器測量每管的放射性活性。

8.從每一管中取出一小份,以末端標記的已知大小(0.2kb~5kb)的 DNA 片斷作標準參

照物,通過1%瓊脂凝膠電泳進行分析,將各管余下部分貯存于-20℃,直至獲得瓊脂糖

凝膠電泳的放射自顯影片。

9.電泳后將凝膠移至一張Whatman 3MM濾紙上,蓋上一張Saran包裝膜,并在凝膠干

燥器上干燥。干燥過程前 20min 30min 50℃加熱凝膠,然后停止加熱,在真空

狀態繼續干燥1~2h.

10  -70℃加增感屏對干燥的凝膠繼續X射線曝光。

11  cDNA長度≥500bp的收集管中,加入0.1倍體積的3mol/Lsuan鈉(pH5.2)和

二倍體積的乙醇。于4℃放置至少15min使cDNA沉淀,用微量離心機于4℃以12 000g

離心15min,以回收沉淀的cDNA

12  DNA溶于總體積為20μl10 mmol/L Tris-HCl(pH7.6)中。

13  測定每一小份放射性活度。算出選定的組分中所得到的總放射性活度值。計算可用于

λ噬菌體臂相連接的DNA總量。

[選定組分的總活度值(cpm)/摻入到DI二鏈的活度值(cpm)]*2xμg cDNADI二鏈合成量

=可用于連接的cDNA

[階段6cDNA與λ噬菌體臂的連接]

1.按下述方法建立4組連接-包裝反應:

連接 A(μl) B(μl) C(μl) D(μl)

λ噬菌體DNA(0.5μg/μl) 1.0 1.0 1.0 1.0

10×T4DNA連接酶緩沖液 1.0 1.0 1.0 1.0

cDNA 0 ng 5 ng 10 ng 50 ng

T4噬菌體DNA連接酶(105 Weiss單位/ml 0.1 0.1 0.1 0.1

10 mmol/L ATP 1.0 1.0 1.0 1.0

H2O 10 10 10 10

連接混合物于16℃培育4~16h。剩余的cDNA儲存于-20℃。

2.按包裝提取物廠商提供的方法,從每組連接反應物中取5μl包裝到噬菌體顆粒中。

3.包裝反應完成后,在各反應混合物中加入0.5ml SM培養基。

4.預備適當的大腸桿菌株新鮮過夜培養物,包裝混合物做 100 倍稀釋,各取10μl 100

μl涂板,于37℃或42℃培養8~12小時。

5.計算重組噬菌斑和非重組噬菌斑,連接反應 A 不應產生重組噬菌斑,而連接反應 BC

D應產生數目遞增的重組噬菌斑。

6.根據重組噬菌斑的數目,計算cDNA的克隆效率。

7.挑取 12 個重組λ噬菌體空斑,小規模培養裂解物并制備 DNA,以供適當的限制性內切

suan酶消化。

8.通過 1%瓊脂凝膠電泳分析 cDNA 插入物的大小,用長度范圍500bp~5

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