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降落PCR

更新時間:2019-03-06瀏覽:1018次

                                                         

 降落PCR 

(如有不明,可以咨詢超博小凌)

降落 PCRtouchdown PCR),一種 PCR 技術,主要用于 PCR 的條件的優化。在許多情

況下引物的設計使得PCR難以進行,例如特異性不夠易錯配等。退火溫度過高會使PCR

率過低,但退火溫度過低則會使非特異擴增過多。 

實驗材料

基因樣品 

儀器、耗材

PCR 

實驗步驟: 

1.  反應體積為50 μl 

 

2.  CD137胞膜外區基因的PCR擴增體系:CD137-pCDNA3質粒4 μlP1P20.5 

μmol/LMgCl2 2 mmol/LdNTP 0.4 mmol/LTaq 5 U 

 

3.  hIgG1Fc片段的PCR擴增體系:含人hIgG1FcPGEM-T質粒4 μlP3P4 0.4 

μmol/LMgCl2 2 mmol/LdNTP 0.4 mmol/LTaq 5 U 

 

4.  HBVDNA多聚酶基因的PCR擴增體系: 

 

1Di一輪:HBVDNA模板4 μlP5P60.25 μmol/LMgCl2 1.5 mmol/LdNTP 

0.2 mmol/LTaq 0.8 U. 

 

2)第二輪:取5倍稀釋的Di一輪PCR產物4μl為模板,P7P80.25 μmol/LMgCl2 1.5 

mmol/LdNTP 0.2 mmol/LTaq 0.8 U 

 

5.  分別在各滅菌PCR管加入上述各反應成分,100煮沸5 min,立即冰浴5 min,加入

TaqDNA聚合酶,混勻,離心,PCR程序如下: 

  

 

6.  10 μl PCR 擴增產物,在2%3%瓊脂糖凝膠上電泳,紫外燈下觀察擴增產物。 

注意事項: 

由于目標是在較早的循環中避免低Tm 值配對,在TD—PCR中應用熱啟動技術。設計

時,退火溫度的范圍應跨越15左右,從高于估計Tm 值至少幾度到低于它10

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