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目的基因PCR擴增產物的克隆

更新時間:2019-03-06瀏覽:2316次

目的基因PCR擴增產物的克隆

 [實驗原理]

1.PCR產物回收

在高離子鹽存在的情況下,DNA片斷選擇性的吸附于離心柱內的硅基質膜上,再通過一系列

快速的漂洗、離心的步驟去蛋白液和漂選液,將引物、核苷酸、蛋白酶等雜質去除,后用低鹽,

pH值的洗脫緩沖液將純凈DNA從硅基質膜上洗脫。

2.T載體與PCR產物的連接

DNA與載體分子的連接就是DNA重組,這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組

DNA分子是在DNA連接酶的作用下,有Mg2+ATP存在的連接緩沖系統中,將分別經酶切

的載體分子與外源DNA分子進行連接。DNA連接酶有兩種:T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌

DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能,而且

T4噬菌體DNA連接酶還有一種大腸桿菌DNA連接酶沒有的特性,即能使兩個平末端的雙鏈DNA

分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接率低,一般可通過提高T4噬菌體DNA連接

酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。T4噬菌體DNA 連接酶催化DNA 連接反應分

3 步:首先,T4 DNA 連接酶與輔因子ATP形成酶-ATP復合物;然后,酶-ATP復合物再結合

到具有5’磷酸基和3’羥基切口的DNA上,使DNA腺苷化;后產生一個新的磷酸二酯鍵,把

切口封起來。連接反應通常將兩個不同大小的片斷相連。因為DNA片斷有兩個端點,所以切割時

出現兩種可能,一種是單酶切,另一種是雙酶切,這兩種酶切方法在基因工程操作中都經常用到。

對于單酶切來說,載體與供體的末端都相同,連接可以在任何末端之間進行,這樣就導致了大量的

自連接產物。為了減少自環的高本底,可對載體進行5’除磷酸處理,原理是連接酶只能連接DNA

片斷的3OH末端與5’端,所以除磷后載體不會自環。一旦有外源片斷插入時,由外源片斷提

5’端就能與載體進行連接。通過這種方法可大大減少由載體的自身成環造成的高本底。對于雙

酶切來說,無論載體與供體同一片段上都有不同的末端,這樣就避免了載體與供體的自環,能使有

效連接產物大大增加。雙酶切的另一個特點是能將供體分子定向連接到載體上。

連接反應的溫度在37℃時有利于連接酶的活性。但是在這個溫度下粘末端的氫鍵結合是不穩

定的。因此采取折中的溫度,即12-16℃,連接12-16h(過夜),這樣既可大限度地發揮連接

酶的活性,又兼顧到短暫配對結構的穩定。Taq DNA酶擴增的PCR產物,其DNA雙鏈前后末端

都有一個游離的A堿基,可以與T -Vector 末端游離的T堿基互補形成環狀重組T質粒。

[實驗材料、試劑和儀器]

PCR擴增相關試劑、PCR儀、移液槍、低溫離心機、瓊脂糖凝膠電泳系統、凝膠成像系統、

PCR產物回收試劑盒、pUCm-T載體。

[實驗步驟]

1PCR擴增

  PCR反應體系:

           

 

 

 

 

 

 

 

 

注:每組做5管,其中4管用于PCR產物回收,1管作電泳檢測時的對照

PCR反應程序:

10×PCR Buffer 2.5 μl

dNTPs 0.5 μl

Taq 0.2 μl

引物1 1.5 μl

引物2 1.5 μl

ddH20 17.3 μl

DNA模板 1.5 μl

(聯系廣州市超博小凌取資料圖)

2.目的基因PCR擴增產物的瓊脂糖電泳檢測

1)制備瓊脂糖凝膠

稱取0.2g瓊脂糖,放入錐形瓶中,加入20ml 1.0×TBE緩沖液,置微波爐或水浴加熱至*

溶化,取出搖勻,則為1%瓊脂糖凝膠液。

2)取有機玻璃內槽,洗凈,晾干,用橡皮膏將有機玻璃內槽的兩端邊緣封好(一定封嚴,

不能留縫隙)。

3)將有機玻璃內槽放置于一水平位置,并放好樣品梳子。

4)將冷到60℃左右的瓊脂糖凝膠液,緩緩倒入有機玻璃內槽,直至有機玻璃板上形成一層

均勻的膠面(注意不要形成氣泡)。

5)待膠凝固后,取出梳子,取下橡皮膏,放在電泳槽內。

6)加入電泳緩沖液至電泳槽中。

7)用移液槍將已加入上樣緩沖液的DNA樣品加入加樣孔中(記錄點樣順序及點樣量)。

1 94℃預變性  5min

2 94℃變性 45s

3 60℃退火 30s

4 72℃延伸 60s

24步驟,35 循環

5 72℃延伸 10min

6 4 保存

8)接通電泳槽與電泳儀的電源(注意正負極,DNA片段從負極向正極移動)。DNA的遷

移速度與電壓成正比,高電壓不超過5V/cm。當溴酚藍染料移動到距凝膠前沿1~2cm處,停止

電泳。

3.產物回收

1)在紫外光下將瓊脂糖凝膠上的目的片段切下,放入1.5 mL Eppendorf離心管中;加入

500μl溶膠/結合液DB,充分混勻。

2)將上一步所得溶液加入吸附柱AC中(吸附柱放入收集管中),室溫放置1 min12000rpm

離心30-60s,倒掉收集管中的廢液。

3)加入700μl漂洗液WB12000rpm離心1min,棄掉廢液。

4)加入500μl漂洗液WB12000rpm離心1 min,棄掉廢液。

5)將吸附柱AC 放回空收集管中,12000rpm離心 2 min,盡量除去漂洗液,以免漂洗液

中殘留乙醇抑制下游反應。

6)取出吸附柱AC,放入一個干凈的離心管中,在吸附膜的中間部位加50μl洗脫緩沖液EB

(洗脫緩沖液事先在65-70℃水浴中加熱效果更好),室溫放置2 min12000rpm離心1 min

如果需要較多量DNA,可將得到的溶液重新加入離心吸附柱,離心1 min

4PCR產物與T載體的連接

對于常規的DNA ligase連接反應,請參考下面的連接反應體系,或按DNA ligase的說明書

進行操作。每個連接反應使用1μl  pMD 18-T載體,約0.2pmol PCR產物,在10μl連接體系中

4℃連接過夜或室溫連接1h

T4 DNA Ligase Buffer(2X)   5μl

Purified PCR Product          1μl

pMD 18-T Vector            1μl

T4 DNA Ligase (5-10U/微升)    1μl

ddH2O                      up to 10μl

5. 大腸桿菌感受態細胞的制備(氯化鈣法)

挑取新鮮的E.coli.DH5α單菌落接種于一個含有10 ml LB液體培養基(不含抗生素)的試

管中,于37℃恒溫振蕩(200 rpm)培養約4h(OD=0.2~0.4),取出后立即將其冰浴10min

在無菌條件下將冰浴后的菌液吸取1ml到冰冷的1.5ml無菌離心管中,于4℃下10000g

離心1min,回收細菌。

每管中加入500 μl4℃下預冷的CaCl2重懸沉淀,冰浴30min,于4℃下10000g離心

1min,回收細菌沉淀物。

每管加入200 μl冰預冷的CaCl2,混勻即為感受態細胞,置4℃冰箱備用。

6. 重組質粒轉化大腸桿菌

10 μl連接產物,加入內裝100 μl感受態細胞的離心管中,輕彈管壁混勻,冰浴30 min

 

42℃熱擊90s后,迅速將離心管冰浴3~5min

加入1 ml不含抗生素的LB液體培養基,混勻,于37 ℃下振蕩培養(180 rpm45 min

 

4℃下,10000 g,離心1 min,吸出500 μl上清液棄去,再混勻,取200 μl涂布于含有

100 μg/ml氨芐青霉素的LB培養基平板上(事先涂布4μl濃度為200 mg/mg IPTG20μl濃度

40 mg/ml X-gal),待菌液被培養基*吸收后,倒置平板于37℃培養12~16h,直至出現單

菌落。再將培養皿置于4℃,使其*顯色(即出現藍、白斑)。

連接產物轉化實驗的同時,以等體積的ddH2O代替連接產物,其操作同上,分別涂布于含

抗生素和不含抗生素的LB平板上,分別作為陰性對照和陽性對照。

7. 重組子克隆的鑒定(本部分視實驗進程而定)

挑取可能含有目的片段的白斑,接種到5 ml LB/Amp液體培養基中,37 220 rpm搖床培

養過夜。采用堿裂解法小量提取菌液質粒DNA,進行PCR擴增,檢測PCR產物是否連接到載體

中。

 

 

附:TBE電泳緩沖液的配制

 

5×TBE5倍體積的TBE貯存液)

1000ml 5×TBE

Tris                      54g

硼酸                     27.5g

0.5mol/l EDTA             20mlpH 8.0

 

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