熟妇高潮喷沈阳45熟妇高潮喷_人妻丰满熟妇av无码区乱_黑人人妻AV一区二区三_少妇太爽丰满一区二区

當前位置:首頁 > 技術文章 > 逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)

逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)

更新時間:2019-03-06瀏覽:4877次

原位雜交實驗

1 探針的設計與合成

1) 根據實驗室已有的p8 基因cDNA全長序列,用premier primer5.0設計引物p81

p82,以鹵蟲 cDNA 為模板,PCR 擴增得到 346bp 的產物,用 Takara 膠回收試劑盒

回收純化。

引物編號 引物序列 長度

p81 TGCGGACGAAACAGGAAG 18 bp

p82 GCTCAAACAGTGATGCCAGT 20 bp

2) 目的片段克隆

a. 在無菌離心管中加入連接載體的各種成分,載體與片段的摩爾比控制在1:3-1:8,根據凝

膠電泳檢測后的濃度及載體與片段分子大小來計算摩爾比。加入成分及比例如下:

目的PCR片段                    5 μl

pGM-T載體(約50ng/uL         1 μl

10×T4 DNA Ligation Buffer         1 μl

T4 DNA Ligase3U/uL           1 μl

無菌去離子水                     3 μl

總體積                           10 μl

b. 輕輕彈動離心管以混合內容物,短暫離心。置于 PCR 儀中 16℃過夜連接,反應結束后

將離心管置于冰上。

c. 向鋪好的含有氨芐青霉素的固體平板表面加入16 μlIPTG 50mg/ml)、40 μlX-gal

20mg/ml),使用無菌的彎頭玻璃棒將其均勻的涂開,避光置于 37℃培養箱 1-3 小時,

使溶解X-gal的二甲基甲酰揮發干凈。

d. 10 μl的連接產物加到100 μl DH5?感受態細胞中,輕彈混勻,冰浴半小時,將離心

管置于 42℃水浴 90 秒,取出管后立即置于冰浴上放置 2-3 分鐘,其間不要搖動離心管。

向離心管加入500 μl 37℃預熱的LB(不含抗生素)培養基,150rpm搖床37℃振蕩培養

45分鐘。目的是使質粒上相關的抗性標記基因表達,使菌體復蘇。將菌液于4000g下離心

10分鐘,去掉上清,加入100 μl培養液重溶并加入到配制好的LB固體培養基上,用無菌

的彎頭玻璃棒輕輕將細胞均勻涂開。待平板表面干燥后,倒置平板,37℃培養12-16小時。

 

e. 挑取白色菌落直接進行PCR檢測,篩選轉化子。

f. 將轉化子接種于LB液體培養基中培養24小時,吸取1mL菌液送至大連寶生物公司進行

序列測序。

3) 重組質粒的線性化

6 μl以測序的重組質粒,選取NcoI內切酶37℃酶切4h。酶切反應體系為20 μl

質粒            6 μl

10xK Buffer      2 μl

NcoI          1 μl

0.1% BSA        2 μl

滅菌水          9 μl

終體積          20 μl

取酶切前后的質粒各 4 μl,經 1%瓊脂糖電泳檢測,確認酶切*,將酶切產物用 Takara

膠回收試劑盒回收純化,作為探針合成的模板。

4) 探針合成

按羅氏DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)試劑盒使用指南,標記反義RNA探針。

使用的所有試劑和器皿均經去 RNase 處理,合成方法如下:先準備反應體系。冰上向

RNase-Free的微離心管中順序加入下列試劑:

純化的線形質粒              1 μg

Rnase-free dH2O                   up to 13 μl

10xNTP labeling mixture        2 μl

10xTranscription buffer         2 μl

Rnase inhibitor                1 μl

SP6 RNA Polymerase           2 μl

總體積                          20 μl

稍混勻,短暫離心將反應液集于管底,37 2 h。反應結束后再補加2 μl DNase I37 15

min,反應結束后加入0.2M EDTA 2 μl 終止反應。取3-5 μl 反應產物1%瓊脂糖凝膠電泳

檢測。-20℃保存備用。

2. 石蠟切片的制備

◆本實驗在雜交結束前均必須保證 RNase-free.玻璃器皿采用 180℃烘烤 10 小時。其它采

DEPC處理,高溫滅菌鍋高溫降解DEPC。若儀器不能高溫處理,可用3%H2O2處理

半小時以上,DEPC水沖洗干凈,烘干。

1) 組織的固定與包埋

選取不同發育時期(0h5h10h15h20h40h3d5d7d)的鹵蟲,經 DEPC

處理水沖洗表面鹽分后,加入新鮮配制的4%多聚甲醛,于4℃固定5-8 h,再分別按下列

順序進行脫水、透明和包埋: 30%乙醇脫水1 h50%乙醇脫水1 h70%乙醇脫水1 h80%

乙醇脫水乙醇脫水1 h90%乙醇脫水1 h,無水乙醇脫水1 h,無水乙醇脫水1 h,無水乙

:二甲苯(1:l)透明10 min,二甲苯透明10 min、二甲苯:54℃石蠟(1:1)浸蠟30 min54

石蠟浸蠟1 h54℃石蠟包埋。

2) 組織切片:將包埋的組織按7 μm的厚度切片,在多聚賴氨酸處理的載玻片上滴加DEPC

處理水,組織片于42℃展片臺上展片1小時,再置于40℃恒溫箱中烘片12小時后放于4

密封保存備用。

3. 雜交前處理

切片經二甲苯脫蠟2×15 min,無水乙醇:二甲苯(1:l) 5 min100%-95%-80%-50%-30%

乙醇脫水各5 min,后DEPC處理水2×5 min,然后進行雜交前切片處理,具體步驟如下:

1) lxPBS(pH7.4)室溫孵育2x5 min

2) 0.3%TtitonX-100 PBS中去膜處理15 min

3) lxPBS洗滌2x5 min

4) RNase的蛋白酶K(20 ?g/mL)37℃消化30 min

5) 100mMGly/PBS中洗 2x5 min

6) lxPBS洗滌2x5 min

7) 4%多聚甲醛(4)固定 5min

8) lxPBS洗滌2x5 min

9) 含有 0.25%(W/v)的乙酸酐的 100mM 的三乙醇胺緩沖液(pH8.0)去電荷處理 15

min(現配現用)

10) lxPBS洗滌2x5 min

4.預雜交和雜交

1) 滴加預雜交液于載玻片上,然后置于濕盒中,50℃預雜交2小時。

2) 棄去預雜交液,立即滴加雜交液,置于濕盒中52℃雜交過夜。

5.雜交后處理

雜交完,以后的步驟不必要特意防RNA酶。

1) 棄去雜交液,載片浸入2xSSC2x15 min

2) 載片浸入1xSSC55℃水浴搖動2x15 min

3) 用含20?g/mLRNaseANTE緩沖液37℃消化 30分鐘,以去除未結合的探針。

4) 載片浸入0.5xSSC55℃水浴搖動2x15 min

5) 載片浸入0.5xSSC中室溫10 min

6. 抗體反應

1) washing buffer清洗組織片5 min

2) 滴加封閉液緩沖液室溫下處理組織片30 min

3) 用抗體液覆蓋封閉后的組織片,置于濕盒中孵育3h以上。

4) Washing buffer 2x15 min

5) Detection buffer 中平衡2-5 min

7. 顯色:加入顯色液于濕盒中黑暗靜止顯色16h

8. 封片與觀察:

1) 顯色合適時,用TE buffer終止著色反應,再用蒸餾水清洗。

2) 滴加封片劑封片,顯微鏡下觀察和攝影

Contact Us
  • 聯系QQ:277124344
  • 聯系郵箱:277124344@qq.com
  • 聯系電話:19540095576
  • 聯系地址:廣州市白云區鶴正街1號中海聯8立方創意園A1棟304室

掃一掃  微信咨詢

© 2024 廣州市超博科技有限公司 版權所有  備案號:

技術支持:        GoogleSitemap

服務熱線
13760660301

微信服務號