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石蠟切片制作(蘇木精-伊紅對染法)

更新時間:2019-03-05瀏覽:3489次

                               

                                    石蠟切片制作(蘇木精-伊紅對染法)

實驗原理:

石蠟切片是基本的切片技術,冰凍切片和超薄切片等都是在石蠟切片基礎上發展起來的。

蘇木素與伊紅對比染色法(簡稱 H.E.對染法)是組織切片常用的染色方法。這種方法適

用范圍廣泛,對組織細胞的各種成分都可著色,便于全面觀察組織構造,而且適用于各種固

定液固定的材料,染色后不易褪色可長期保存。經過HE染色,細胞核被蘇木素染成藍紫色,

細胞質被伊紅染色呈粉紅色。

一、器材及試劑:

1. 器材:

切片刀,切片機,恒溫箱,蠟杯,酒精燈,解剖刀,解剖剪,解剖盤,培養皿,鑷子,

單面刀片,毛筆,包埋盒,染色缸,蓋玻片,載玻片,玻片盤,樹膠,樹膠瓶,顯微鏡,溫

度計,臉盆,水浴鍋。

切片機,切片刀,溫臺,恒溫箱,解剖刀,鑷子,剪刀,解剖針,單面刀片,小臺木,灑精

燈,包埋紙盒,染色缸,燒杯,水盆,熔蠟爐,蠟杯。

2.試劑:

中性福爾馬林固定液、各種濃度的酒精、二甲苯、石蠟、蜂蠟、蘇木精染液, 1%

紅酒精溶液,1%鹽酸酒精溶液,甘油蛋白粘片劑,中性樹膠。

卡諾(Carnoy)固定液,埃利希蘇木精染液,1%伊紅酒精溶液,1%鹽酸乙醇液,各級酒

精(30%50%70%80%90%95%100%),二甲苯,甘油蛋白粘片劑,中性樹

膠。

3. 材料:

鼠肝、腎、心肌、骨骼肌或其他組織、大豆或小麥、綠豆、洋蔥、大蒜、蠶豆的根、

莖、葉等。

二、實驗原理:

石蠟切片是基本的切片技術,冰凍切片和超薄切片等都是在石蠟切片基礎上發展起來

的。蘇木素與伊紅對比染色法(簡稱 H.E.對染法)是組織切片常用的染色方法。這種方

法適用范圍廣泛,對組織細胞的各種成分都可著色,便于全面觀察組織構造,而且適用于各

種固定液固定的材料,染色后不易褪色可長期保存。經過HE染色,細胞核被蘇木素染成藍

紫色,細胞質被伊紅染色呈粉紅色。

三、試劑配法:

1.中性甲醛固定液:

       甲醛(37%-40%,市售,本所購買即為此濃度)  100mL

       磷酸氫二鈉                                 6.5

       磷酸二氫鉀(鈉)                           4g       

雙蒸水                                    900mL                                     

2.蘇木精、伊紅染色液為碧云天產品

31%鹽酸乙醇液

鹽酸 1

70%酒精 100

4.甘油蛋白貼片劑:

蛋白 50 ml

甘油 50 ml

水楊酸鈉(防腐劑) 1g

配制時將雞蛋一個打破入碗或杯中,去蛋黃留下蛋白,用玻棒調打成雪花狀泡沫,然后

用粗紙或雙層紗布過濾到量筒中,經數小時或一夜,即可濾出透明蛋白液。此時在其中再加

等量的甘油,稍稍振搖使兩者混合。后加入防腐劑(水楊酸鈉)作防腐用。可保存幾個月。

四、實驗步驟:

1.取材

頸椎脫臼法處死小鼠,打開腹腔,剪取肝組織(或其他組織)。

切取的組織塊不宜太大,以利于固定劑穿透,通常以5mm×5mm×2mm10 mm×10

mm×2 mm為宜。取下所需要的肝組織,切成一小塊23mm厚。

注意事項:

1)取材動作要迅速,不宜作太久的拖延以免組織細胞的成分、結構等發生變化。

2)切片材料應根據需要觀察的部位進行選擇,盡可能不要損傷所需要的部分。

2.固定

將切好的肝組織用生理鹽水組織洗一下,立即投入中性福爾馬林固定液中固定,固定

3050min

注意事項:

1)一般固定液,都以新配為好,配好后應貯存在陰涼處,不宜放在日光下,以免引起化

學變化,失去固定作用。

2)有些混合固定液的成份之間會發生氧化還原作用,一定要在使用前才混合,如果混合

太早,固定時就沒有作用了。

3)固定材料時,固定液必須充足,一般為材料塊的 20~30 倍,有些水分多的材料,中

間應更換1-2次新液。

4)材料固定完畢后,保存于嚴密緊塞或加蓋的容器里,同時在容器外上標簽,并隨同材

料在溶液中投入相應的標簽,以免相互混淆。標簽上注明固定液、材料來源、日期等。標簽

上的文字,應用黑色鉛筆或繪圖黑墨水書寫。

3. 洗滌

材料經固定后,流水沖洗,數小時或過夜。

4. 脫水

材料依次經70%80%90%各級乙醇溶液脫水,各30min,再放入95%100%

2次,每次20min。各

注意事項:

1)脫水必須在有蓋的玻璃品中進行,防止吸收空氣中的水分。

2)在更換高一級的脫水劑時,不要移動材料以免損壞,可用吸管吸出器皿中的脫水

劑,再用吸水吸盡器皿內剩余液,然后于皿中加入高一級脫水劑。

3)在低濃度酒精中,每級停留不宜太長,否則易使組織變軟,助長材料的解體。

4)在高濃度或純酒精中,每級停留的時間也不宜太長,否則會使組織變脆,影響切片。

5)如需過夜,應停留在70%酒精中。

6)脫水必須*,否則不易透明,甚至使透明劑內出現白色混濁現象

5.透明

純酒精、二甲苯等量混合液15min,二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ15min(至透明為止)。

由于乙醇與石蠟不相溶,而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蠟,所以脫水后還要經過

二甲苯以過渡。當組織中全部被二甲苯占有時,光線可以透過,組織呈現出不同程度的透明

狀態。

透明注意事項

1)使用透明劑時,要隨時蓋緊蓋子,以免空氣中的水分進入。

2)更換每級透明劑,動作要迅速,一方面為了不使材料塊干涸,另一方面能避免吸收濕

氣。

3)在透明過程中, 如果材料周圍出現白色霧狀,說明材料中的水未被脫凈,應退回純

酒精中重新脫水,然后再透明。

6.透蠟

放入二甲苯和石蠟各半的混合液15min,再放入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ透蠟各50-60分鐘。

透蠟的目的是除去組織中的透明劑(如二甲苯等),使石蠟滲透到組織內部達到飽和程

度以便包埋。透蠟時間根據組織大小而定。透蠟應在恒溫箱內進行,并保持箱內溫度在

55-60℃左右,注意溫度不要過高,以免組織發脆。一般置于恒溫箱0.5h

透蠟注意事項

1)盡量保持在較低溫度中進行,以石蠟不凝固為度;

2)透蠟溫度要恒定,不可忽高忽低;

3)操作要迅速,力求在短的時間內完成石蠟透入過程,以免引起組織變硬、變脆、收

縮等。

7. 包埋

包埋時,用鑷子夾取石蠟模子(金屬質地)在酒精燈上稍加熱,放在平的桌面上,從

溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯,倒入少許石蠟。再將鑷子在酒精燈上稍加熱,夾取材料將切

面朝下放入蠟模中,排列整齊。再放上包埋盒,輕輕倒入熔蠟。

8. 切片

①將已固定和修好的石蠟塊裝在切片機的夾物臺上。

②將切片刀固定在刀夾上,刀口向上。

③搖動推動螺旋,使石蠟塊與刀口貼近,但不可超過刀口。

④調整石蠟塊與刀口之間的角度與位置,刀片與石蠟切片約成15度左右。

⑤調整厚度調節器到所需的切片厚度,一般為4-10微米。

⑥一切調整好后主可以開始切片。此時右手搖動轉輪,讓蠟塊切成蠟帶,左手持毛筆將蠟帶

提起,搖轉速度不可太急,通常以40-50r/min

⑦切成的蠟帶到20-30cm長時,右手用另一支毛筆輕輕將蠟帶挑起,以免卷曲,并牽引成

帶,平放在蠟帶盒上,靠刀面的一面較光滑,朝下,較皺的一面朝上。

⑧用單面刀片切取蠟片一小段,放在載玻上加水一滴,置于放大鏡或顯微鏡下觀察切片是否

良好。

⑨切片工作結束后,應將切片刀取下用氯 FANG擦去刀上沾著的石蠟,把切片機擦拭干凈妥為保存。

9. 展片、貼片

打開水浴鍋,使水溫維持在40-45℃,另準備30%乙醇溶液。

切片時,將一碗30%乙醇溶液放于切片機旁的桌面上。

用小鑷子夾取預先用刀片割開的蠟帶,放在乙醇溶液的水面上,使切片展開。

③小鑷子輕輕地將連在一起的切片分開,用一個載玻片將切片完整,已展開的切片撈至溫水

中,使之充分展開。

另取潔凈的載玻片,撈起展開的切片,使其位于切片1/3處,另一端(磨邊,粗糙的一

端)磨面上標記或貼上標簽,放于切片架上。

10. 脫蠟復水

    將水浴鍋溫度調至60℃,待水溫控制在60℃時,將切片連同切片架放入一干燥的染色

缸內,放入水浴鍋中,蓋上蓋子(可密封),30min至蠟熔化。

之后,石蠟切片經二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各5min,然后放入100%95%90%80%

 

 

 

70%各級酒精溶液中各3-5min,再放入蒸餾水中3min

11 染色

切片放入蘇木精中染色約10-30min

染色時間應根據染色劑的成熟程度及室溫高低,適當縮短或延長。室溫高時促進染色,

染色時間可短些,否則可適當延長時間,冬季室溫低時可放入恒溫箱中染色。

12.水洗

用自來水流水沖洗約15min。使切片顏色變藍(或放入堿性水中也可),但要注意流水

不能過大,以防切片脫落。

13.分化

將切片放入1%鹽酸乙醇液中褪色,約2秒至數十秒鐘。見切片變紅,顏色較淺即可。

 

14.漂洗

切片再放入自來水流水中使其恢復藍色。

15.脫水Ⅰ

切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3-5min

16、復染

0.5%伊紅乙醇液對比染色1-3min

伊紅主要染細胞質,著色濃淡應與蘇木精染細胞核的濃淡相配合,如果細胞核染色較

濃,細胞質也應濃染,以獲得鮮明的對比。反之,如果細胞核染色較淺,細胞質也應淡染。

可在伊紅乙醇液中滴加數滴冰醋酸助染,促使細胞質容易著色,并且經乙醇脫水時不易褪色。

 

17.脫水Ⅱ

將切片放入 95%乙醇中洗去多余的紅色,然后放入無水乙醇中 3-5min。后用吸水

紙吸干多余的乙醇。

18.透明

切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3-5min

二甲苯應盡量保持無水,應經常更換,或用紗布包無水硫酸銅放入染色缸內吸收水分。

切片如在二甲苯中出現白霧現象,說明脫水未盡,應退回乙醇中重新脫水,否則切片難以鏡

檢。

19.封藏:中性樹膠封存

因切片經二甲苯透明,使用中性樹膠作為封藏劑,樹膠可用二甲苯稀釋至合適的稠度。

 

封藏的方法:

封片前應根據材料的大小,選用不同規格的蓋玻片。材料透明后,在桌上放一張潔凈的

吸水紙,將含材料的載玻片從二甲苯中取出放在紙上(切片的一面向上),迅速地在切片的

中央滴一滴樹膠(千萬不能待二甲苯干燥后再進行),用右手持小鑷子輕輕地夾住蓋玻片的

右側,稍為傾斜使其左側與封藏劑接角,然后再緩慢地將蓋玻片放下,這樣就可以減少或避

免產生氣泡。如膠液不足,可以用玻棒再滴一滴樹膠從蓋玻片邊緣補足。如膠液過多,可在

干燥以后用刀刮去,并用紗布蘸二甲苯拭去殘留的樹膠。

染色結果:細胞核被蘇木素染成藍色,細胞質被伊紅染色呈粉紅色。

  

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