熟妇高潮喷沈阳45熟妇高潮喷_人妻丰满熟妇av无码区乱_黑人人妻AV一区二区三_少妇太爽丰满一区二区

當前位置:首頁 > 技術文章 > siRNA表達載體的構建

siRNA表達載體的構建

更新時間:2019-03-05瀏覽:1552次

                                                   

siRNA表達載體的構建 

siRNA 表達載體構建可以:(1)作為后基因組時代基因功能分析的有力工具;(2)應用于

基因組學、細胞信號傳導通路分析;(3)用于藥物靶點篩選、疾病治療。 

實驗方法原理

多數的 siRNA 表達載體依賴三種 RNA 聚合酶 III 啟動子(pol III)中的一種,操縱一段小的

發夾RNA(short hairpinRNA, shRNA)在哺乳動物細胞中的表達。這三類啟動子包括大家

熟悉的人源和鼠源的 U6 啟動子和人 H1 啟動子。之所以采用 RNA polIII 啟動子是由于它

可以在哺乳動物細胞中表達更多的小分子 RNA,而且它是通過添加一串(3 6 個)U

終止轉錄的。要使用這類載體,需要訂購2段編碼短發夾RNA序列的DNA單鏈,退火,

克隆到相應載體的pol III 啟動子下游。由于涉及到克隆 ,這個過程需要幾周甚至數月的時

間,同時也需要經過測序以保證克隆 的序列是正確的。 

實驗材料

目的基因 

試劑、試劑盒: 

LB培養基 

儀器、耗材: 

離心管、離心機、水浴鍋、漩渦振蕩儀等 

實驗步驟: 

一、目的基因的確定 

1.  檢索文獻獲取有實驗證明有效的靶點序列(核對)。 

2.  NCBI查閱:聯系超博獲取

3.  搜索引擎輔助:聯系超博獲取

、設計siRNA靶序列 

在制備 siRNA 前都需要單獨設計 siRNA 序列.研究發現對哺乳動物細胞,有效的 siRNAs

21-23 個堿基大小、3’端有兩個突出堿基的雙鏈 RNA;而對非哺乳動物,比較有效的

是長片段 dsRNAsiRNA 的序列專一性要求非常嚴謹,與靶 mRNA 之間一個堿基錯配都

會顯著削弱基因沉默的效果。 

1.  選擇siRNA靶位點 

從轉錄AUG起始密碼子開始,搜尋下游AA序列,記錄跟每個AA 3’端相鄰的19個核苷

酸作為候選的siRNA靶位點。有研究結果顯示GC含量在30%-50%左右的siRNA要比那

GC含量偏高的更為有效。Tuschl等建議在設計siRNA時不要針對5'3'端的非編碼區

untranslated regions,UTRs),原因是這些地方有豐富的調控蛋白結合區域,而這些UTR

結合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響 siRNP 核酸內切酶復合物結合 mRNA 從而影響

siRNA的效果。 

2.  序列同源性分析 

將潛在的序列和相應的基因組數據庫(人或者小鼠、大鼠等等)進行比較,排除那些和其他

編碼序列/EST 同源的序列。例如使用 BLAST(聯系超博獲取)選出合

適的目標序列進行合成.并非所有符合條件的siRNA都一樣有效,其原因還不清楚,可能是位

置效應的結果,因此對于一個目的基因,一般要選擇3-5個靶位點來設計siRNA 

通常來說,每個目標序列設計3-4siRNAs,選擇有效的進行后續研究。 

3.  設計陰性對照 

一個完整的 siRNA 實驗應該有陰性對照,作為陰性對照的 siRNA 應該和選中的 siRNA

列有相同的組成,但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA中的堿

基序列打亂。當然,同樣要保證它和其他基因沒有同源性。 

三、表達載體的選用 

1.  化學合成與體外轉錄方法都是在體外得到 siRNA 后再導入細胞內,但是這兩種方法主

要有兩方面無法克服的缺點:siRNA進入細胞后容易被降解;進入細胞siRNA在細胞內的

RNAi 效應持續時間短.針對這種情況,出現了質粒、病毒類載體介導的 siRNA 體內表達。

該方法的基本思路是:將 siRNA 對應的 DNA 雙鏈模板序列克隆入載體的 RNA 聚合酶 III

的啟動子后,這樣就能在體內表達所需的 siRNA 分子。這種方法總體的優點在于不需要直

接操作RNA,能達到較長時間的基因沉默效果。 

2.  通過質粒表達siRNAs大都是用Pol III啟動子啟動編碼shRNA(small hairpin RNA)

序列。選用 Pol III 啟動子的原因在于這個啟動子總是在離啟動子一個固定距離的位置開始

轉錄合成 RNA,遇到 4—5 個連續的 U 即終止,非常精確。當這種帶有 Pol III 啟動子和

shRNA模板序列的質粒轉染哺乳動物細胞時,這種能表達siRNA的質粒確實能夠下調特定

基因的表達,可抑制外源基因和內源基因。采用質粒的優點在于,通過 siRNA 表達質粒的

選擇標記,siRNA 載體能夠更長時間地抑制目的基因表達。當然還有一點,那就是由于質

粒可以復制擴增,相比起其它合成方法來說,這就能夠顯著降低制備siRNA的成本。 

3.  帶有抗生素標記的 siRNA 表達載體可用于長期抑制研究,通過抗性輔助篩選,該質粒

可以在細胞中持續抑制靶基因的表達數星期甚至更久。同時 RNAi-Ready 表達載體還能與

逆轉錄病毒和腺病毒表達系統整合(BD Knockout RNAi Systems),大大提高siRNA表達

載體對宿主細胞的侵染性,*克服某些細胞轉染效率低的障礙,是實現哺乳動物細胞

siRNAs瞬時表達與穩定表 達的理想工具。 

四、合成模板 

1.  合成編碼 shRNADNA 模板的兩條單鏈,模板鏈后面接有RNA PolyIII聚合酶轉錄

中止位點,同時兩端分別設計 BamH I Hind III 酶切位點,可以克隆到 siRNA 載體多

克隆位點的 BamH I Hind III 酶切位點之間。 

2.  955 min,緩慢退火, DNA 單鏈得到 shRNA DNA 雙鏈模板。 

五、連接與轉化 

1.  100 μl感受態細胞于冰上解凍。 

2.  5 μl 連接產物加入到感受態細胞中,輕輕旋轉幾次以混勻內容物,在冰上放置 30

分鐘。 

3.  將管放入預加溫到 42的水浴中,熱激 90 秒。快速將管轉移到冰浴中,使細胞冷卻

1~2分鐘。 

4.  每管中加700 μl LB培養基,37振蕩培養1小時,進行復蘇。 

5.  室溫4 000 rpm離心5分鐘,棄去上清后,用剩余100 μl培養基重懸細胞并涂布到含

抗性的LB瓊脂平板表面.注意:細胞用量應根據連接效率和感受態細胞的效率進行調整。 

6.  將平板置于室溫直至液體被吸收。 

7.  倒置平皿,于37培養,12~16小時后可出現菌落。 

六、PCR鑒定和測序鑒定 

在插入編碼shRNADNA雙鏈模板兩側設計鑒定PCR引物,擴增片段在100-200bp

間。 

注意事項: 

1. 從轉錄本(mRNA)的 AUG 起始密碼開始,尋找“AA”二連序列,并記下其 3’端的

19 個堿基序列,作為潛在的 siRNA 靶位點。有研究結果顯示 GC 含量在 30%—50%左右

siRNA要比那些GC 含量偏高的更為有效。 

Tuschl等建議在設計siRNA時不要針對5’ 3’端的非編碼區(untranslated regions

UTRs),原因是這些地方有豐富的調控蛋白結合區域,而這些 UTR 結合蛋白或者翻譯起始

復合物可能會影響siRNP核酸內切酶復合物結合mRNA從而影響siRNA的效果。 

2. 將潛在的序列和相應的基因組數據庫(人,或者小鼠,大鼠等等)進行比較,排除那些

和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST(聯系超博獲取) 

3.  選出合適的目標序列進行合成。通常一個基因需要設計多個靶序列的siRNA,以找到

有效的siRNA序列。 

4.  一個完整的siRNA實驗應該有負對照,作為負對照的siRNA應該和選中的siRNA序列

有相同的組成,但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂,

同樣要檢查結果以保證它和其他基因沒有同源性。 

如果計劃合成siRNA,那么可以直接提供以AA打頭的21個堿基序列,廠家會合成一對互

補的序列。注意的是通常合成的siRNA是以3’dTdT結尾,如果要UU結尾的話通常要特

別說明。有結果顯示,UU結尾和dTdT結尾的siRNA在效果上沒有區別。因為這個突出端

無需和靶序列互補。 

其他: 

一、siRNA操作成功要點  

1. 對每個基因設計并檢測兩到四個siRNA序列 

為了找到潛在靶位點,掃描靶基因中的 AA 序列。記錄每個 AA 3’ 19 個核苷酸作為潛

siRNA 靶位點。潛在靶位點需通過 GENBANK 數據庫的 BLAST 分析,去除那些與其它

基因明顯同源的靶位點。如果可能,siRNA應根據mRNA低二級結構的區域設計。 

2.  選擇低GC含量的siRNA 

Ambion公司研究發現GC 含量在40-55%siRNA55%以上的活性高。 

3.  純化體外轉錄siRNA 

在轉染前要確認siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA,推薦用玻璃纖維結合,洗

(Ambion siRNA 體外合成試劑盒中已包括純化柱保證 siRNA 純度)或通過 15-20%丙烯

酰胺膠除去反應中多余的核苷酸,小的寡核苷酸,蛋白和鹽離子。注意:化學合成的 RNA

通常需要跑膠電泳純化(PAGE膠純化) 

4.  避免RNA酶污染 

微量的RNA酶將導致siRNA實驗失敗。由于實驗環境中RNA酶普遍存在,如皮膚,頭發,

所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品因此保證實驗每個步驟不受 RNA 酶污染非

常重要。Ambion公司在這方面有一整套的產品線,如除RNA酶的噴劑,拭紙及液劑,檢

測和去除RNA酶。 

5.  健康的細胞培養物和嚴格的操作確保轉染的重復性 

通常,健康的細胞轉染效率較高。此外,較低的傳代數能確保每次實驗所用細胞的穩定性。

為了優化實驗,推薦用50代以下的轉染細胞,否則細胞轉染效率會隨時間明顯下降。 

6. 避免適用抗生素 

Ambion公司推薦從細胞種植到轉染后72小時期間避免使用抗生素。抗生素會在穿透的細

胞中積累毒素。有些細胞和轉染試劑在 siRNA 轉染時需要無血清的條件。這種情況下,可

同時用正常培養基和無血清培養基做對比實驗,以得到好轉染效果。QIAGEN 推出的專

門針對RNA轉染的試劑 

7.  選擇好的轉染試劑轉染siRNA 

針對靶細胞類型,選擇好的轉染試劑和優化的操作對 siRNA 實驗的成功至關重要。siRNA

實驗要求選擇適合轉小的 RNA 的轉染試劑(目前大多數轉染試劑都針對轉染比較大的質粒

DNA,而非小的 RNA 分子,宿主范圍大小也不同)Ambion 公司的 Silencer siRNA 

Transfection KitQIAGENTransmessenger Transfection Reagent都是專門針對轉

siRNA優化的轉染試劑,是您的理想選擇。 

8.  通過合適的陽性對照優化轉染和檢測條件 

對大多數細胞,看家基因是較好的陽性對照。將不同濃度的陽性對照的siRNA轉入靶細胞(

樣適合實驗靶siRNA),轉染48小時后統計對照蛋白或mRNA相對于未轉染細胞的降低水

平。過多的siRNA將導致細胞毒性以至死亡。Ambion公司提供多種靶基因的陽性siRNA 

9.  通過陰性對照siRNA排除非特異性影響 

合適的陰性對照可通過打亂活性 siRNA 的核苷酸順序設計而得。必須注意它要進行同源比

較確保相對所要研究的生物的基因組沒有同源性。 

10.  通過標記siRNA來優化實驗 

熒光標記的 siRNA 能用來分析 siRNA 穩定性和轉染效率。標記的siRNA 還可用作 siRNA

胞內定位及雙標記實驗(配合標記抗體)來追蹤轉染過程中導入了 siRNA 的細胞,將轉染與

靶蛋白表達的下調結合起來。

Contact Us
  • 聯系QQ:277124344
  • 聯系郵箱:277124344@qq.com
  • 聯系電話:19540095576
  • 聯系地址:廣州市白云區鶴正街1號中海聯8立方創意園A1棟304室

掃一掃  微信咨詢

© 2024 廣州市超博科技有限公司 版權所有  備案號:

技術支持:        GoogleSitemap

服務熱線
13760660301

微信服務號