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RNA干擾實驗

更新時間:2019-03-03瀏覽:1972次

                                                             RNA干擾實驗

(如需詳細資料,請聯系超博科技小凌)

一、磷酸鈣轉染法

【實 理】

磷酸鈣沉淀法是基于磷酸鈣-DNA復合物的一種將DNA導入真核細胞的轉染方法。磷酸鈣

有利于促進外源DNA與靶細胞表面的結合。磷酸鈣-DNA復合物粘附到細胞膜并通過胞飲

作用進入靶細胞,被轉染的DNA可以在細胞內進行瞬時表達,也可整合到靶細胞的染色體

上從而產生不同基因型和表型的穩定克隆。該方法可廣泛用于轉染許多不同類型的細胞。 

【儀器、材料和試劑】

(一)儀器、用具

CO2培養箱、10cm細胞培養平板、巴斯德吸管、微量移液器、15ml錐形管、燒杯、量筒

等。 

(二)材料

呈指數生長的真核細胞BALB/c 3T3

CsCl純化的表達質粒DNA

(三)試劑

1.*培養液 

DMEM 90ml

FCS 10ml

22M CaCl2,過濾除菌,-20℃保存備用

32×HEBS (g/500ml)

NaCl 8.0

KCl 0.38

Na2HPO4.7H2O 0.19

HEPES 5.0

葡萄糖 1.0

NaOH調pH6.95,過濾除菌后,-20℃保存備用。

【方法與步驟】

1.在10cm的培養板上接種1×106BALB/c 3T3細胞

第二天進行轉染

2.準備CaPO4沉淀

2.1 準備兩組試管

A管中加入: 15μg質粒DNA

69μl 2M CaCl2 

460μl重蒸水

B管中加入: 550μl 2×HEBS 

2.2 用巴斯德吸管將 A 管中的溶液緩慢地逐滴加入在 B 管中,同時用另一吸管吹打 B 管溶

液,整個過程需緩慢進行,至少需持續12min 

2.3室溫靜置30min,出現細小顆粒沉淀。

3. 小心地將沉淀逐滴均勻地加入培養細胞的10cm平板中,輕輕晃動(此過程需盡快完成)。

 

4. 5%CO2的加濕培養箱中培養細胞2-6 hr

5. 除去培養液,加入10ml*培養液培養細胞1-6天(依具體情況而定)。

6. 收集細胞進行基因活性的檢測,或分散接種到其他培養皿中進行選擇培養。

【注 項】

1.在整個轉染過程中要保持無菌操作。

2.在實驗中使用的各種試劑都必須小心校準,保證質量。

3.質粒DNA CsCl純化,乙醇沉淀后的DNA應保持無菌,在無菌水或Tris- EDTA

溶解。

4.沉淀物的大小和質量對于磷酸鈣轉染的成功至關重要。在磷酸鹽溶液中加入DNA-CaCl2

溶液時需用空氣吹打,以確保形成盡可能細小的沉淀物,因為成團的DNA不能有效地黏附

和進入細胞。

二、電穿孔和電融合技術

[實驗原理]

當細胞置于非常高的電場中,細胞膜就變得具有通透性,能讓外界的分子擴散進細胞內,這

一現象稱為電穿孔。運用這一技術,許多物質,包括DNARNA、蛋白質、藥物、抗體和

熒光探針都能載入細胞。作為一種基因轉導方法,電穿孔已被廣泛用于各種細胞類型,包括

細菌、酵母、植物和動物細胞;而且,它還能作為注射方法(稱為電注射),把各種外源物

質引入活細胞。與其他常用的導入外源物質的方法相比,電穿孔具有很多優點。首先,不必

象顯微鏡那樣使用玻璃針,不需要技術培訓和昂貴的設備,可以一次對成百萬的細胞進行注

射。第二,與用化學物質相比,電穿孔幾乎沒有生物或化學副作用。第三,因為電穿孔是一

種物理方法,較少依賴細胞類型,因而應用廣泛。實際上,對大多數細胞類型,用電穿孔法

基因的轉移效率比化學方法高得多。 

除了能使細胞膜具有通透性,讓外界的分子擴散入胞液中以外,高強度的電場脈沖也能引起

細胞融合,這一現象叫做電融合。然而,在用電脈沖融合前必須使細胞相互緊密接觸,這一

電融合方法在原生質融合制取雜交植物,胚胎細胞相互融合制備動物克隆方面非常有用,尤

其在制取雜交瘤細胞制備單克隆抗體方面用處很大。幾個實驗室已證明使用電場電融合效率

比常規的化學融合方法高10100倍,近來,貼壁細胞的電融合還被用來研究細胞融合時

細胞的骨架成分和細胞器的動力學重排。

[儀器、材料和試劑]

(一)儀器:

脈沖發生器,樣品池:一個盛細胞的容器和兩個平行的金屬電極,CO2 培養箱,離心機,

顯微鏡,微量移液器,鑷子,剪刀,三角瓶,吸管,毛細管,離心管等。 

(二)材料:

(三)試劑:

穿孔介質(PM):15mmol/L磷酸鉀 1mmol/L MgCl2 250mmol/L蔗糖(或甘露醇)

10mmol/L HEPES 調節pH7.3

融合介質(FM):1mmol/L MgCl2 280mmol/L甘露醇 2mmol/L HEPES 調節pH

7.3

[方法與步驟]

一.懸浮細胞的電穿孔法:

1電穿孔進行基因轉移

電穿孔可用于將多種不同類型的分子載入活細胞中,操作步驟非常相似。以下我們用基因轉

移作為例子。載入其他的分子可按以下相同步驟進行,只需把外源DNA換頁所需分子即可。

 

1.1 使細胞在適宜的培養基中生長,用胰酶處理,收獲對數生長中期的細胞,并用腺酶處

理。

1.2 在穿孔介質(PM)中至少洗一次。洗細胞時,在臺式離心機上1000rpm離心3分鐘,

使得懸浮細胞沉降。然后,去掉上清液,在新的介質中重新懸浮細胞。

1.3 計數細胞,在PM 中,濃縮細胞為大約1千萬細胞/ml

1.4 DNA 加到細胞懸液中,充分混合,使 DNA 均勻分散,用吸管吸一定體積的細胞

-DNA混合液到裝有電極的滅菌小樣品池中。

1.5 在電穿孔裝置上設置輸出電壓和脈沖寬度(脈沖寬度是指數衰減函數的時間常數,即

τ=RCC 是電容,R 是樣品的電阻)。假如設備是 CD 脈沖型發生器,設定電容和并聯電

阻,以達到合適的τ值。 

1.6 將小池放進盛樣品的池中,啟動電穿孔裝置,供給所需的電脈沖。

1.7 電處理后,向小池加1ml普通培養基,將細胞混合液從小池轉移到組織培養容器(培

養皿或培養孔)中,再加入一些培養基使之后的培養基體積適量。然后,將樣品細胞放回孵

育箱中使之在正常條件下生長。

1.8 在測定轉移基因的表達量前電穿孔細胞各自培養的時間不同。

2檢測電穿孔效率和細胞存活率

2.1 除用羅丹明偶聯葡聚糖(1mg/ml)(分子探針)代替 DNA 外,將羅丹明偶聯葡聚糖

引入目標細胞的方法如前所述。

2.2 電穿孔后,用培養基洗滌細胞兩次,去掉胞外的熒光葡聚糖。 

2.3 電穿孔后30min,向細胞懸液中加30μl臺盼藍,孵育2min,然后用培養基洗滌。

2.4 1000rpm下離心3min,收集細胞,將細胞重懸于PM中,終體積100μl

2.5 將一滴細胞液(30μl)置于干凈載玻片上,用蓋玻片蓋好,在顯微鏡下檢測細胞,測定

攝取熒光標記葡聚糖的百分數。

2.6 在亮視野鏡片下,死細胞可因染成藍色檢測出(攝取了臺盼藍),測定細胞存活的百分

數。

2.7 在各種電場設定值下重復實驗,畫出攝取葡聚糖率和細胞存活率對電穿孔參數的曲線。

這一曲線就將顯示對特定細胞類型電穿孔的zui優條件。

二.懸浮生長細胞的電融合 

融合懸浮細胞的步驟與電穿孔的很類似,只是在進行高強度的電場脈沖前后,必須用低幅、

高頻電場使細胞排成一條鏈。

1 用融合介質(FM)洗懸浮細胞兩次,然后懸于 FM 中。洗滌細胞時,在臺式離心機上

1000rpm下離心3分鐘,得到細胞沉淀,棄去上清液將細胞懸于新鮮FM介質中。

2 將懸浮細胞轉移到相應的融合室內。假如要使兩種不同的細胞彼此融合,轉移前要充分

混合。

3 啟動介電電泳場,其振幅通常小于200V/cm,頻率在2MHz以內,用顯微鏡檢測細胞是

否排成一條鏈,調節振幅和頻率以達到zui佳效果。

4 讓介電電泳場開約 1 分鐘后關掉,立即應用融合脈沖,其振幅數量級為 1kV/cm。脈沖

寬度小于1ms。在進行融合脈沖后立即再次啟動介電電泳場,常規讓其開啟約2分鐘。

5 關掉介電電泳場,讓細胞在樣品池中靜置10分鐘。

6 去掉FM,用普通培養基再次洗滌細胞。

7 將細胞轉移到培養皿,加入普通培養基,在培養箱一般條件下培養。

[注意事項]

1 Zui優組分依使用的特定細胞種類而有明顯的變化。如果努力優化電壓和脈沖寬度電穿孔

結果仍不令人滿意,就應嘗試改變穿孔介質。

2 影響電穿孔/電融合的另一重要因素與細胞狀態有關,為達到zui高效率,必須收集對數生

長中期的細胞。

1.純化siRNA 

在轉染前要確認siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA,推薦用玻璃纖維結合,洗

脫或通過15-20%丙烯酰胺膠除去反應中多余的核苷酸,小的寡核苷酸,蛋白和鹽離子。注

意:化學合成的RNA通常需要跑膠電泳純化(即PAGE膠純化)。 

2.避免RNA酶污染 

微量的RNA酶將導致siRNA實驗失敗。由于實驗環境中RNA酶普遍存在,如皮膚,頭發,

所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品等,此保證實驗每個步驟不受RNA酶污染非

常重要。

3.健康的細胞培養物和嚴格的操作確保轉染的重復性 

通常,健康的細胞轉染效率較高。此外,較低的傳代數能確保每次實驗所用細胞的穩定性。

為了優化實驗,推薦用50代以下的轉染細胞,否則細胞轉染效率會隨時間明顯下降。 

4.避免使用抗生素 

抗生素會在穿透的細胞中積累毒素。有些細胞和轉染試劑在siRNA轉染時需要無血清的條

件。這種情況下,可同時用正常培養基和無血清培養基做對比實驗,以得到zui佳轉染效果。

 

5.選擇合適的轉染試劑 

針對siRNA制備方法以及靶細胞類型的不同,選擇好的轉染試劑和優化的操作對siRNA

驗的成功至關重要。 

 

6.通過合適的陽性對照優化轉染和檢測條件 

對大多數細胞,看家基因是較好的陽性對照。將不同濃度的陽性對照的siRNA轉入靶細胞

(同樣適合實驗靶siRNA),轉染48小時后統計對照蛋白或mRNA相對于未轉染細胞的降

低水平。過多的siRNA將導致細胞毒性以至死亡。

7.通過標記siRNA來優化實驗 

熒光標記的siRNA能用來分析siRNA穩定性和轉染效率。標記的siRNA還可用作siRNA

胞內定位及雙標記實驗(配合標記抗體)來追蹤轉染過程中導入了siRNA的細胞,將轉染

與靶蛋白表達的下調結合起來。

RNAi研究的一般技術路線是:

 

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