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Northern Blot原理及實驗方法

更新時間:2019-03-03瀏覽:2783次

Northern Blot原理及實驗方法 

原理:在變性條件下將待檢的RNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳,繼而將在凝膠中的位置轉移

到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上,固定后再與同位素或其它標記物標記的RNA探針進行反應。

 

用途:檢測樣品中是否含有基因的轉錄產物(mRNA)及其含量。  

實驗方法: 

[儀器、試劑、材料] 

(一)儀器恒溫水浴箱,電泳儀,凝膠成像系統,真空轉移儀,真空泵,UV交聯儀,雜交

爐,恒溫搖床,脫色搖床,漩渦振蕩器,分光光度計,微量移液器,電爐(或微波爐),離

心管,燒杯,量筒,三角瓶等。 

(二)材料總RNA樣品或mRNA樣品,探針模板DNA(25 ng),尼龍膜 

(三)試劑:NorthernMax Kit(Cat. # 1940,Ambion, Inc.),瓊脂糖,DEPC, X光底片,

底片暗盒,Random Primer, dNTP Mixture,111 TBq/mmol[a-32P]dCTP,Exo-free 

Klenow Fragment和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS,雙氧水,滅菌水等。 

 

[方法與步驟] 

1.用具的準備: 

180度烤器皿:三角錐瓶、量筒、鑷子、刀片等4小時。電泳槽:清洗梳子和電泳槽,并用

雙氧水浸泡過夜,用DEPC水沖洗,干燥備用。處理DEPC水(2 L)備用。 

 

2.用 RNAZaP 去除用具表面的 RNase 酶污染用 RNAZap 擦洗梳子,電泳槽,刀片等,

然后用DEPC水沖洗二次,去除RNAZap。 

 

3.制膠:  

1. 稱取0.36mg瓊脂糖加入三角錐瓶中,加入32.4mlDEPC水后,微波爐加熱至瓊脂糖完

全熔解。60℃空氣浴平衡溶液 (需加DEPC水補充蒸發的水分) 

 2. 在通風廚中加入3.6ml 的10*Denaturing Gel buffer,輕輕振蕩混勻。注意盡量避

免產生氣泡。 

3. 將熔膠倒入制膠板中,插上梳子如果膠溶液上存在氣泡,可以用熱的玻璃棒或其它方

法去除,或將氣泡推到膠的邊緣。注:膠的厚度不能超過0.5cm。 

4.膠在室溫下*凝固后,將膠轉移到電泳槽中,加入1x MOPS Gel Running buffer蓋

過膠面約1cm,小心拔出梳子。(配制250ml 1×MOPS Gel Running buffer,在電泳過

程中補充蒸發的buffer。) 

5.檢查點樣孔。 

 

4. RNA樣品的制備 

在RNA樣品中加入3倍體積的formaldehyde load dye和適當的EB(終濃度為10ug/ml)。

混勻后,65℃空氣浴15min。短暫低速離心后,立即放置于冰上5min。 

 

5.電泳: 

1.將RNA樣品小心加到點樣孔中。 

2.在5V/cm 下跑膠(5x14cm)。在電泳過程中,每隔30min 短暫停止電泳,取出膠,混

勻兩極的電泳液后繼續電泳。當膠中的溴紛藍(500bp)接近膠的邊緣時終止電泳。 

3.紫外燈下,檢驗電泳情況,并用尺子測量18S、28S、溴紛藍到點樣孔的距離。注意不要

讓膠在紫外燈下曝光太長時間。 

 

 

6.轉膜 

1.用3%雙氧水浸泡真空轉移儀后,用DEPC水沖洗。 

2.用RNAZap擦洗多孔滲水屏和塑膠屏,用DEPC水沖洗二次。 

3.連接真空泵和真空轉移儀,剪取一塊適當大小的膜(膜的四邊緣應大于塑膠屏孔口的

5mm),膜在Transfer buffer浸濕5分鐘后,放置在多孔滲水屏的適當位置。 

4.蓋上塑膠屏,蓋上外框,扣上鎖。 

5.將膠的多余部分切除,切后的膠四邊緣要能蓋過塑膠屏孔,并至少蓋過邊緣約2mm,以

防止漏氣。 

6.將膠小心放置在膜的上面,膜與膠之間不能有氣泡。 

7.打開真空泵,使壓強維持在50~58mbar;立即將transfer buffer加到膠面和四周。每

隔10min在膠面加上1ml transfer buffer,真空轉移2小時。 

8.轉膜后,用鑷子夾住膜,于1x MOPS Gel Running buffer中輕輕泡洗10秒,去除殘余

的膠和鹽。 

9.用吸水紙吸取膜上多余的液體后,將膜置于UV交聯儀中自動交聯。 

10.將膠和紫外交聯后的膜,在紫外燈下檢測轉移效率。(避免太長的紫外曝光時間) 

12.將膜在-20℃保存。 

7.探針的制備 

1.在1.5ml離心管中配制以下反應液:模板DNA(25 ng)    1ul 

Random Primer 2ul滅菌水 11ul總體積:14ul 

2.95°C加熱3分鐘后,迅速放置于冰冷卻5min。 

3.在離心管中按下列順序加入以下溶液: 

10×Buffer 2.5ul 

dNTP Mixture 2.5ul 

111 TBq/mmol[a-32P]dCTP 5 ul 

Exo-free Klenow Fragment 1 ul 

4.混勻后(25ul), 37°C下反應30分鐘。短暫離心,收集溶液到管底。 

5.65°C加熱5min使酶失活。    

8.探針的純化及比活性測定: 

1.準備凝膠:將1g凝膠加入30ml的DEPC水中,浸泡過夜。用DEPC水洗滌膨脹的凝膠

數次,以除去可溶解的葡聚糖。 

2.取1ml一次性注射器,去除內芯推捍,將注射器底部用硅化的玻璃纖維塞住,在注射器

中裝填Sephadex G-50凝膠。 

3.將注射器放入一支15ml離心管中,注射器把手架在離心管口上。1600g離心4分鐘,凝

膠壓緊后,補加Sephadex G-50凝膠懸液,重復此步直至凝膠柱高度達注射器0.9ml刻度

處 

4.100ul STE緩沖液洗柱,1600g離心4min。重復3次。 

5.倒掉離心管中的溶液后,將一去蓋的1.5ml離心管置于管中,再將裝填了Sephadex G-50

凝膠的注射器插入離心管中,注射器口對準1.5ml離心管。 

6.將標記的DNA樣品加入25 ul STE,取出0.5ul點樣于DE8 paper上,其余上樣于層

析柱上。 

7.1600g離心4min,DNA將流出被收集在去蓋的離心管中,而未摻入DNA的dNTP則

保留在層析柱中。取0.5ul己純化的探針點樣于DE8-paper. 

 8. 測比活性。  

 

 

9.預雜交: 

1.將預雜交液在雜交爐中68℃預熱,并漩渦使未溶解的物質溶解。 

2.加入適當的ULRAhyb到雜交管中(以100cm2膜面積加入10mlULRAhyb雜交液),42℃

預雜交4 hr。 

 

10.探針變性: 

1.用10 mM EDTA將探針稀釋10倍。 

2.90℃熱處理稀釋后探針10min后,立即放置于冰上5min。 

3.短暫離心,將溶液收集到管底。 

 

11.雜交: 

1.加入0.5ml ULTRAhyb到變性的探針中,混勻后,將探針加到預雜交液中。 

2.42℃雜交過夜(14~24hr)。雜交完后,將雜交液收集起來于-20℃保存。 

 

12.洗膜:  

1.低嚴緊性洗膜:加入Low Stringency Wash Solution#1 (100cm2膜面積加入20ml洗

膜溶液),室溫下,搖動洗膜5min兩次。  

2.高嚴緊性洗膜: 加入High Stringency Wash Solution#2 (100cm2膜面積加入20ml

洗膜溶液),42℃ 搖動洗膜20min兩次。  

 

13.曝光: 

1. 將膜從洗膜液中取出,用保鮮膜包住,以防止膜干燥。 

2. 檢查膜上放射性強度,估計曝光時間 

3. 將X光底片覆蓋與膜上,曝光 

4. 沖洗X光底片,掃描記錄結果。 

 

14.去除膜上的探針:將200ml 0.1%SDS(由DEPC 水配制)煮沸后,將膜放入,室溫

下讓SDS冷卻到室溫,取出膜,去除多余的液體,干燥后,可以保存幾個月。 

 

15.雜交結果  

 

操作應該小心,但不必緊張。用于RNA電泳、轉膜的所有器械、用具均須處理以除去RNAse

酶,以免樣品的降解。轉膜時,注意膜和多孔滲水屏之間不要有氣泡 

 

 

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