熟妇高潮喷沈阳45熟妇高潮喷_人妻丰满熟妇av无码区乱_黑人人妻AV一区二区三_少妇太爽丰满一区二区

當前位置:首頁 > 技術文章 > mRNA的分離純化

mRNA的分離純化

更新時間:2019-03-03瀏覽:2552次

                                         

                                                      mRNA的分離純化

(內有數據圖,如有需要請聯系超博小凌)

mRNA的分離純化

【實驗原理】

真核生物的mRNA分子是單順反子,是編碼蛋白質的基因轉錄產物。真核生物的所有蛋白

質歸根到底都是 mRNA 的翻譯產物,因此,高質量 mRNA 的分離純化是克隆基因、提高

cDNA文庫構建效率的決定性因素。哺乳動物平均每個細胞含有約1x10-5 g RNA,理論

上認為每克細胞可分離出510mg RNA。其中 rRNA75%~ 85%,tRNA10%~

16%,而mRNA僅占 1%5%,并且mRNA分子種類繁多,分子量大小不均一,表達豐

度也不一樣。

         真核生物 mRNA 有特征性的結構,即具有 5’端帽子結構(m7G)和 3’端的

poly(A)尾巴——絕大多數哺乳動物細胞的 3’端存在 20~300 個腺苷酸組成的 polyA

尾,通常用 polyA+)表示,這種結構為真核 mRNA 分子的提取、純化,提供了極為方

便的選擇性標志,寡聚(dT)纖維素或寡聚(U)瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論

基礎就在于此。

        一般mRNA分離純化的原理就是根據mRNA 3 末端含有多poly(A)尾巴結構特

性設計的。當總 RNA 流經寡聚(dT)(即 oligo(dT))纖維素柱時,在高鹽緩沖液作用下,

mRNA被特異地吸附在oligo(dT)纖維素柱上,在低鹽濃度或蒸餾水中,mRNA可被洗下,

經過兩次oligo(dT)纖維素柱,即可得到較純的mRNA

        目前常用的mRNA的純化方法有:

       1)寡聚(dT)-纖維素柱層析法,即分離mRNA的標準方法;

       2)寡聚(dT)-纖維素液相離心法,即用寡聚(dT)-纖維素直接加入到總的 

RNA溶液中并使mRNA與寡聚(dT)-纖維素結合,離心收集寡聚(dT)-纖維素/mRNA

復合物,再用洗脫液分離mRNA,然后離心除去寡聚(dT)-纖維素;

 2 / 8

 

        3)其它一些方法:如寡聚(dT)-磁性球珠法等。

         本實驗應用方法(1)進行mRNA的分離純化。

 

【試劑與器材】

(一)試劑

1 0.1mol/L NaOH ,每組200mL 

2 寡聚OligodT-纖維素

3 加樣/洗滌緩沖液10.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6),每組 250mL

0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(pH8.0), 0.1% SDS

4 洗滌緩沖液 20.1 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6),每組 250mL

10mmol/L Tris-HCl (pH7.6), 1mmol/L EDTA (pH8.0), 0.05% SDS

        配制時可先配制Tris-HCl(pH 7.6)NaClEDTApH 8.0)的母液,經高壓消毒

后按各成分確切含量,經混合后再高壓消毒,冷卻至 65℃時,加入經 65℃溫育(30min

10%SDS至終濃度。

5 5 mol/L NaCl,每組10mL

6 3 mol/L NaAc pH5.2,每組10mL

7 RNase雙蒸水(DEPC),每組100mL

8 70%乙醇,每組10mL

 

注意:溶液5 6的配制都應該加0.1% DEPC處理過夜,溶液1 3 4 8則用經0.1% DEPC

處理過的無RNase雙蒸水配制,Tris應選用無RNase的級別。溶液配制后,zui好能夠按一

次實驗所需的分量分裝成多瓶(如10ml50ml/瓶)保存,每次實驗只用一份,避免多次

 3 / 8

 

操作造成對溶液的污染。

 

(二)器材

1 恒溫水浴箱

2 冷凍高速離心機

3 紫外分光光度計

4 巴斯德吸管

5 玻璃棉

6 5ml一次性注射器

 

【操作方法】

(一) oligo(dT)纖維素的預處理

1 0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g oligo(dT)纖維素。 

2 將懸浮液裝入填有經 DEPC 水處理并經高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中,柱床體積

0.5-1.0mL,用3倍柱床體積的無RNase的滅菌雙蒸水沖洗oligo(dT)纖維素。 

3 3-5倍柱床洗滌緩沖液I沖洗oligo(dT)纖維素,直到流出液的pH 值小于8.0

4 將處理好的 oligo(dT)纖維素從巴斯德吸管倒出,用適當的柱床洗滌緩沖液 I 懸浮,濃

度約為0.1g/mL,保存在4℃待用。

 

(二) RNA濃度的調整

1 把實驗一所提的總RNA轉到適合的離心管中,如果總RNA的濃度大于0.55mg/mL

則用無RNase的雙蒸水稀釋至0.55mg/mL,總 RNA的濃度對除去rRNA是很重要的。把

 4 / 8

 

RNA溶液置于65℃水浴加熱5 分鐘,然后迅速插在冰上冷卻。

2 加入1/10體積5 mol/L NaCl使RNA溶液中鹽的濃度調至0.5 mol/L

 

(三) mRNA的分離

1 mRNAOligo(dT)-纖維素結合:用移液器重新懸浮oligo(dT)-纖維素,按下表取適

量的 oligo(dT)-纖維素到 RNA 樣品中,蓋上蓋子,顛倒數次將 oligo(dT)-纖維素與 RNA

混勻。于37℃水浴保溫并溫和搖蕩15分鐘。

RNA

(mg) 

 寡聚Oligo(dT)-纖維素

(mL)

 洗滌緩沖液12

(mL)

洗脫體積

(mL) 

<0.2  0.2 1.0   1.0

 0.2-0.5  0.5  1.5  1.5

 0.5-1.0  1.0  3.0  3.0

 1.0-2.0  2.0  5.0  5.0

 

2 轉移:取 1 5ml 的一次性注射器,取適量經過高溫滅菌的玻璃棉塞緊前端,并把它

固定在無 RNase 的支架上,再把 oligo(dT)-纖維素/RNA 懸浮液轉移到注射器,推進塞子

直至底部,把含有未結合上的 RNA 液體排到無 RNase 的離心管中(保留至確定獲得足夠

mRNA)。

3 洗滌:根據上表直接用注射器慢慢吸取適量的洗滌緩沖液1,溫和振蕩,充分重新懸浮

mRNA-oligo(dT)-纖維素,推進塞子,用無 RNase 的離心管收集洗出液。測定每一管的

OD260,當洗出液中OD0時準備洗脫。

4 洗脫:根據上表直接用注射器慢慢吸取適量(2-3 倍柱床體積)的洗脫緩沖液 2 或無

 5 / 8

 

RNase雙蒸水到注射器內充分重懸mRNA-oligo(dT)-纖維素,推進塞子以1/31/2柱床

體積分管收集洗脫液。

5 測定每一管的OD260,合并含有RNA的洗脫液組分于4℃,2500g,離心2-3分鐘,

上清轉移至新的離心管中,去掉殘余的oligo(dT)-纖維素。

6 沉淀:洗脫液中加入 1/10 體積的3mol/L NaAc pH5.2, 再加入2.5 倍體積的冰

冷乙醇,混勻后,-2030分鐘或放置過夜。

7 離心收集:12000g, 4℃離心15 分鐘,小心棄去上清,mRNA沉淀此時往往看不見,

70%乙醇漂洗沉淀,12000g, 4℃離心5 分鐘,小心棄去上清液,沉淀空氣干燥10分鐘,

或真空干燥10分鐘。將mRNA沉淀溶于適當體積的無RNase的雙蒸水,立即用于cDNA

合成(或保存在70%乙醇中并貯存于-70℃)。

8 定量:測定OD260OD280,計算產率以及OD260/OD280的比率(同上一實驗)。

 

【注意事項與提示】

1 整個操作過程必須嚴格遵守無RNase操作環境規則。

2 提取的總RNA必須完整,不能被降解,這是mRNA質量的先決條件。

3 RNAOligo(dT)-纖維素的比例要適當,過量的總RNA,容易造成mRNA不純。

 

4 RNA 溶液與Oligo(dT)-纖維素結合前必須置于65℃加熱 5 分鐘,這一步很重要,其

作用(1)破壞 mRNA 的二級結構,特別是 poly(A+)尾處的二級結構,使 poly(A+)尾充

分暴露,提高poly(A+)RNA回收率;(2)解離mRNArRNA的結合。加熱后應立即插

入冰上,以免由于溫度的緩慢下降使mRNA又恢復其二級結構。

5 應注意mRNA不能被DNA污染,即使是1 ppm DNA污染,也可嚴重影響實驗結果。

6 mRNA 制備后,可用變性瓊脂糖凝膠電泳撿測其完整性和有無 DNA 污染。提取的

 6 / 8

 

mRNA應該在0.5~8.0kb之間呈現彌散狀,無明顯區帶,但大部分的mRNA應在1-2.0kb

范圍內(如下圖)。一般來說,經過一次純化分離的 mRNA 還會有微量的 rRNA 殘留,但

一般來說不會對后續實驗造成很大的影響,如果樣品充足,可將經過一次純化分離的mRNA

再純化一次,進一步提高其純度。

 

3.1   mRNA變性瓊脂糖凝膠電泳示意圖

Lane 1, 0.247.5kb RNA分子量Maker;

Lane 2, 老鼠肝臟總 RNA;

Lane 3, 老鼠肝臟mRNA

7 為防止 mRNA 降解,應避免多次凍融,可將 mRNA 少量分裝后保存。另外,如果有

低溫冰箱,zu好在 -70℃~ -80℃保存。 也可將mRNA70%乙醇中-70℃保存一年以上。

 

8 寡聚(dT)纖維素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗凈,然后用層析柱加樣緩沖液平衡,并

加入 0.02%疊氮鈉(NaN3)冰箱保存,重復使用。每次用前需用 NaOH、滅菌 ddH2O

層析柱加樣緩沖液依次淋洗柱床。

9 一般而言,107哺乳動物培養細胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA,約相當于上柱總RNA

量的1%-2%

 

 7 / 8

 

【實驗安排】

1 一天:試劑的配制和所用一次性塑料制品和玻璃器皿的去RNase 處理(0.1%DEPC

浸泡或高溫干烤)。

2 二天:進行(一)、(二)和(三)1-6

3 三天:進行(三)7和變性瓊脂糖凝膠電泳撿測mRNA

4 為了避免由于保存時間過長造成的RNA降解,zui好能將總RNA提取、mRNA的分離

純化、RT-PCRcDNA文庫構建實驗安排在連續的時間內進行。

 

其他:

引物的設計一般遵循的原則:

1)典型的引物20-24個核苷長。引物需要足夠長,保證序列*性,并降低序列存在于非

目的序列位點的可能性。但是太長的引物可能會與錯誤配對序列雜交降低了特異性,同時因

比短序列雜交慢,從而降低了產量。

2)設計 5'端和中間區為 G C,且 GC 含量為 50~60%的引物,以增加引物的穩定性

及其與目的序列雜交的穩定性。

33'末端盡量不要富含 GC。設計引物時保證在zui 5 個核苷中含有 3 A T。但因為

3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸,為了避免3'末端的錯誤配對,所以末端盡量

避免為核苷A

4)在引物對3'末端盡量避免互補序列以免形成引物二聚體,抑制擴增。如果引物序列可能

產生內部二級結構會破壞引物退火穩定性,也要盡量避免。

此外,目的序列上并不存在的附加序列,如限制位點和啟動子序列,可以加入到引物 5'

而不影響特異性。

 8 / 8

 

        有時候,僅有有限的序列信息可供用于引物設計。比如,如果僅知道氨基酸序列,

可以設計簡并引物,同時使用較高的引物濃度(1μM 3μM),因為許多簡并混合物中的

引物不是特異性針對目的模板。

        為了增加特異性,可以參考密碼子使用表,根據不同生物的堿基使用偏好,減少簡

并性。次黃嘌呤可以同所有的堿基配對,降低引物的退火溫度。不要在引物的 3'端使用簡

并堿基,因為3'zui3個堿基的退火足以在錯誤位點起始PCR

 

Contact Us
  • 聯系QQ:277124344
  • 聯系郵箱:277124344@qq.com
  • 聯系電話:19540095576
  • 聯系地址:廣州市白云區鶴正街1號中海聯8立方創意園A1棟304室

掃一掃  微信咨詢

© 2024 廣州市超博科技有限公司 版權所有  備案號:

技術支持:        GoogleSitemap

服務熱線
13760660301

微信服務號