熟妇高潮喷沈阳45熟妇高潮喷_人妻丰满熟妇av无码区乱_黑人人妻AV一区二区三_少妇太爽丰满一区二区

當前位置:首頁 > 技術文章 > 原代細胞培養和傳代培養的方法

原代細胞培養和傳代培養的方法

更新時間:2019-02-27瀏覽:1961次

                                                  原代細胞培養和傳代培養的方法 

原代培養 

原理  

    將動物機體的各種組織從機體中取出,經各種酶(常用胰蛋白酶)、螯合劑(常用EDTA)

或機械方法處理,分散成單細胞,置合適的培養基中培養,使細胞得以生存、生長和繁殖,

這一過程稱原代培養。      

儀器、材料及試劑  

    儀器:培養箱(調整至37℃),培養瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液

管、紗布、手術器械、血球計數板、離心機、水浴箱(37℃)  

    材料:動物組織塊  

    試劑:1640培養基(含20%小牛血清),0.25%胰酶,Hank′s液,碘酒 

初代消化培養法 

1. 準備:取各種已消毒的培養用品置于凈化臺面,紫外線消毒20分鐘。開始工作前先洗

手、75%酒精擦拭手至肘部。 

2. 布局:點燃酒精燈,安裝吸管帽。 

3. 處理組織:把組織塊置于燒杯中,用Hanks液漂洗 2~3次,去除血污;如懷疑組織可

能污染,可先置于含有青鏈霉素的混合液中30~60分鐘。 

4. 剪切:用眼科剪把組織切成2~3毫米大小的塊,以便于消化。加入比組織塊總量多

30~50倍的胰蛋白酶液,然后一并倒入三角燒瓶中,結扎瓶口或塞以膠塞。 

5. 消化:或用恒溫水浴,或置于37℃溫箱消化均可,消化中每隔20分鐘應搖動一次,如

用電磁恒溫攪拌器消化更好。消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定。 

6. 分離:在消化過程中見消化液發混濁時,可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察,如組織

 

 

已分散成細胞團或單個細胞,立即終止消化,隨即通過適宜不銹鋼篩,濾掉尚未充分消化

開的組織塊。低速(500~1000轉/分)離心消化液5分鐘,吸出上清,加入適量含有血

清的培養液。 

7. 計數:用計數板計數,如細胞懸液細胞密度過大,再補加培養液調整后,分裝入培養瓶

中。對大多數細胞來說,pH 要求在7.2~7.4 范圍,培養液呈微紅色,如顏色偏黃,說明

液體變酸,可用NaHCO3調整。 

8. 培養:置于36.5℃溫箱培養,如用CO2溫箱培養,瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽堵塞,

紗布塞易生霉菌,每次換液時需要換新塞。 

初代組織塊培養法 

1. 剪切:把組織小塊置于小燒杯或青霉素小瓶中,用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血

污,吸靜Hanks液,用眼科剪反復剪切1mm3塊為止。 

2. 擺布:用彎頭吸管吸取若干小塊,置于培養瓶中,用吸管彎頭把組織小塊擺布在培養瓶

底部,小塊相互距離以0.5cm為宜,每一25ml培養瓶底可擺布20~30塊。 

3. 輕輕翻轉培養瓶,另瓶底向上,注意翻瓶時勿另組織小塊流動,塞好瓶塞,置36.5℃

溫箱培養2小時左右(勿超過4小時),使小塊微干涸。 

4. 培養:從微箱中取出培養瓶,開塞,46度斜持培養瓶,箱瓶底腳部輕輕注入培養液少

許,然后緩緩再把培養瓶翻轉過來,讓培養液慢慢覆蓋附于瓶地上的組織小塊。置溫箱中

靜止培養。待細胞從組織塊游出數量增多后。再補加培養液。 

傳代培養法 

原理  

    細胞在培養瓶長成致密單層后,已基本上飽和,為使細胞能繼續生長,同時 

也將細胞數量擴大,就必須進行傳代(再培養)。 傳代培養也是一種將細胞種保存下去

的方法。同時也是利用培養細胞進行各種實驗的必經過程。懸浮型細胞直接分瓶就可以,

而貼壁細胞需經消化后才能分瓶。 

材料和試劑  

1. 細胞:貼壁細胞株  

2. 試劑:0.25%胰酶、1640培養基(含10%小牛血清)  

3. 儀器和器材:倒置顯微鏡,培養箱、培養瓶、吸管、廢液缸等 

   操作步驟 

1. 吸除培養瓶內舊培養液。 

2. 向瓶內加入胰蛋白酶和EDTA混合液少許,以能覆滿瓶底為限。 

3. 置溫箱中2~5分鐘,當發現細胞質回縮,細胞間隙增大后,立即終止消化。 

4. 吸除消化液,向瓶內注入Hanks液數毫升,輕輕轉動培養瓶,把殘余消化液沖掉。注

意加Hanks液沖洗細胞時,動作要輕,以免把已松動的細胞沖掉流失,如用胰蛋白酶液單

獨消化,吸除胰蛋白酶液后,可不用Hanks液沖洗,直接加入培養液。 

5. 用吸管吸取營養液輕輕反復吹打瓶壁細胞,使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。 

6. 計數板計數后,把細胞懸液分成等份分裝入數個培養瓶中,置溫箱中培養。 

無菌操作注意事項  

1. 操作前要洗手,進入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要

擦試。  

2. 點燃酒精燈,操作在火焰附近進行,耐熱物品要經常在火焰上燒灼,金屬器械燒灼時間

不能太長,以免退火,并冷卻后才能夾取組織,吸取過營養液的用具不能再燒灼,以免燒

焦形成碳膜。  

3. 操作動作要準確敏捷,但又不能太快,以防空氣流動,增加污染機會。  

4. 不能用手觸已消毒器皿的工作部分,工作臺面上用品要布局合理。  

5. 瓶子開口后要盡量保持45℃斜位。  

6. 吸溶液的吸管等不能混用。 

 

 

 

Contact Us
  • 聯系QQ:277124344
  • 聯系郵箱:277124344@qq.com
  • 聯系電話:19540095576
  • 聯系地址:廣州市白云區鶴正街1號中海聯8立方創意園A1棟304室

掃一掃  微信咨詢

© 2024 廣州市超博科技有限公司 版權所有  備案號:

技術支持:        GoogleSitemap

服務熱線
13760660301

微信服務號