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實時熒光定量PCR具體實驗步驟

更新時間:2019-02-22瀏覽:4643次

                                                  實時熒光定量PCR具體實驗步驟 

1 樣品RNA的抽提 

①取凍存已裂解的細胞,室溫放置5分鐘使其*溶解。 

②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯fang,蓋緊管蓋。手動劇烈

振蕩管體15秒后,15 到30℃孵育2 到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后

混合液體將分為下層的紅色酚氯fang相,中間層以及無色水相上層。RNA 全部被分配于水相

中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。 

③RNA沉淀 將水相上層轉移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀

其中的 RNA,混勻后15 到 30℃孵育 10 分鐘后,于 4℃下 12000rpm 離心 10 分鐘。此

時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。 

④RNA 清洗 移去上清液,每 1mlTRIZOL 試劑裂解的樣品中加入至少 1ml 的 75%乙醇

(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混勻后,4℃下7000rpm離心5分鐘。  

⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。  

⑥溶解 RNA 沉淀 溶解 RNA 時,先加入無 RNA 酶的水 40μl 用槍反復吹打幾次,使其完

全溶解,獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。 

2 RNA質量檢測 

1)紫外吸收法測定 

先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。然后取少量 RNA溶液用TE稀釋(1:100)后,

讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值,測定RNA溶液 濃度和純度。 

① 濃度測定 

A260下讀值為1表示 40 µg RNA/ml。樣品RNA濃度(µg/ml)計算公式為:A260 ×稀釋

倍數× 40 µg/ml。具體計算如下: 

RNA溶于40 µl DEPC水中,取5ul,1:100稀釋至495µl的TE中,測得A260 = 0.21 

RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 µg/ml = 840 µg/ml 或 0.84 µg/µl  

取5ul用來測量以后,剩余樣品RNA為35 µl,剩余 RNA總量為: 

35 µl × 0.84 µg/µl = 29.4 µg 

②純度檢測 

RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度,比值范圍1.8到2.1。 

2)變性瓊脂糖凝膠電泳測定 

①制膠 

1g瓊脂糖溶于72ml水中,冷卻至60℃,10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 

甲醛溶液(12.3 M)。 

10×MOPS電泳緩沖液 

濃度  成分  

0.4M  MOPS,pH 7.0 

0.1M  乙酸鈉 

0.01M  EDTA 

灌制凝膠板,預留加樣孔至少可以加入25 µl溶液。膠凝后取下梳子,將凝膠板放入電泳槽

內,加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。 

②準備RNA樣品 

取3µgRNA,加 3倍體積的甲醛上樣染液,加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10µg/ml。

加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。 

③電泳 

上樣前凝膠須預電泳5min,隨后將樣品加入上樣孔。5–6V/cm電壓下2h,電泳至溴酚蘭

指示劑進膠至少2–3cm。 

④紫外透射光下觀察并拍照 

28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃(其大小決定于用于抽提RNA的物種類型),上

面一條帶的密度大約是下面一條帶的 2 倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶,它由

低分子量的RNA(tRNA和5S核糖體RNA)組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到

一片彌散的 EB 染色物質,可能是由 mRNA 和其它異型 RNA 組成。RNA 制備過程中如果

出現DNA污染,將會在28S核糖體RNA帶的上面出現,即更高分子量的彌散遷移物質或

者帶,RNA的降解表現為核糖體RNA帶的彌散。用數碼照相機拍下電泳結果。 

3樣品cDNA合成 

①反應體系 

序號  反應物  劑量 

1  逆轉錄buffer  2μl 

2  上游引物  0.2μl 

3  下游引物  0.2μl 

4  dNTP  0.1μl 

5  逆轉錄酶MMLV  0.5μl 

6  DEPC水  5μl 

7  RNA模版  2μl 

8  總體積  10μl 

 

輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心。 

②混合液在加入逆轉錄酶 MMLV 之前先 70℃干浴 3 分鐘,取出后立即冰水浴至管內外溫

度一致,然后加逆轉錄酶0.5μl,37℃水浴60分鐘。 

③取出后立即95℃干浴3分鐘,得到逆轉錄終溶液即為cDNA溶液,保存于-80℃待用。 

4梯度稀釋的標準品及待測樣品的管家基因(β-actin)實時定量PCR  

①β-actin 陽性模板的標準梯度制備 陽性模板的濃度為 1011,反應前取 3μl 按 10 倍稀釋

(加水27μl并充分混勻)為1010,依次稀釋至109、108、107、106、105、104,以備用。

 

②反應體系如下: 

標準品反應體系 

序號  反應物  劑量 

1   SYBR Green 1 染料  10μl 

2  陽性模板上游引物F  0.5μl 

3  陽性模板下游引物R  0.5μl 

4  dNTP  0.5μl 

5  Taq酶  1μl 

6  陽性模板DNA  5μl 

7  ddH2O  32.5μl 

8  總體積  50μl 

輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心。 

管家基因反應體系: 

序號  反應物  劑量 

1  SYBR Green 1 染料  10μl 

2  內參照上游引物F  0.5μl 

3  內參照下游引物R  0.5μl 

4  dNTP  0.5μl 

5  Taq酶  1μl 

6  待測樣品cDNA  5μl 

7  ddH2O  32.5μl 

8  總體積  50μl 

輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心。 

③制備好的陽性標準品和檢測樣本同時上機,反應條件為:93℃ 2分鐘,然后93℃ 1分

鐘,55℃ 2分鐘,共40個循環。 

5 制備用于繪制梯度稀釋標準曲線的DNA模板 

①針對每一需要測量的基因,選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應。 

反應體系: 

序號  反應物  劑量 

1  10× PCR緩沖液  2.5 ul 

2  MgCl2 溶液  1.5 ul 

3  上游引物F  0.5 ul 

4  下游引物R  0.5 ul 

5  dNTP混合液  3 ul 

6  Taq聚合酶  1 ul 

7  cDNA  1 ul 

8  加水至總體積為  25ul 

輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心。 

35個PCR循環(94℃1分鐘;55℃1分鐘;72℃1分鐘); 72ºC延伸5分鐘。 

②PCR 產物與 DNA Ladder 在 2%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色,檢測 PCR 產物是否

為單一特異性擴增條帶。 

③將 PCR 產物進行 10 倍梯度稀釋: 將 PCR 產物進行 10 倍梯度稀釋: 設定 PCR 產物濃度

為1×1010,依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個濃度梯度。 

6 待測樣品的待測基因實時定量PCR  

①所有cDNA樣品分別配置實時定量 PCR反應體系。 

體系配置如下: 

序號  反應物  劑量 

1  SYBR Green 1 染料   10 ul 

2  上游引物  1ul 

3  下游引物  1ul 

4  dNTP   1ul 

5  Taq聚合酶  2ul 

6  待測樣品cDNA  5ul 

7  ddH2O   30ul 

8  總體積  50 ul 

輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心。 

②將配制好的PCR反應溶液置于Realtime PCR儀上進行PCR擴增反應。反應條件為:93℃

2分鐘預變性,然后按93℃ 1分鐘,55℃1分鐘,72℃1分鐘,共40做個循環,后72℃

7分鐘延伸。 

7 實時定量PCR使用引物列表 

引物設計軟件:Primer Premier 5.0,并遵循以下原則:引物與模板的序列緊密互補;引物

與引物之間避免形成穩定的二聚體或發夾結構;引物不在模板的非目的位點引發DNA 聚合

反應(即錯配)。 

 

8 電泳 

各樣品的目的基因和管家基因分別進行Realtime PCR反應。PCR產物與 DNA Ladder在

2%瓊脂糖凝膠電泳,GoldView™染色,檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。 

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