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小鼠骨髓與骨內膜間充質干細胞分析

更新時間:2018-12-27瀏覽:3371次

小鼠骨髓與骨內膜間充質干細胞分析
Flow Cytometry Analysis of Mouse Bone Marrow and Endosteum Mesenchymal Stromal Cells   

摘要:骨髓間充質干細胞 (Mesenchymal Stromal Cells,MSCs) 是骨髓中具有自我更新能力,和成骨、成軟骨和成脂肪多向分化潛能的成體干細胞。MSC具有在體外形成纖維細胞集落 (CFU-F) 和在體內、外分化為骨、軟骨和脂肪細胞的能力。本文以小鼠骨髓組織為例,使用5種一抗和1種二抗,介紹在骨髓腔和骨內膜分離、標記MSC的方法,用此法標記的MSCs還可進行細胞周期、凋亡等實驗。

材料與試劑

  1. 15 ml離心管
  2. 1.5 ml EP管
  3. 70 μm濾膜 (Fisherbrand, catalog number: 22363548)
  4. 小鼠 (C57BL/6J,6~8周齡,雄雌各半)
  5. 胎牛血清 (FBS, Gibco, catalog number: 10100147)
  6. Liberase (Roche, catalog number: 5401020001)
  7. DNaseI (Roche, catalog number: 10104159001)
  8. 流式抗體如下表1

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       同型對照抗體如下表 2

 

  1. 磷酸緩沖液 (10x PBS, Sangon biotech, catalog number: E607016-0500)
  2. 氯化銨 (天津大茂化學,catalog number: 12125-02-9)
  3. 碳酸氫鈉 (Sigma-Aldrich, catalog number: S5761,500G)
  4. EDTA粉末 (鼎國,catalog number: LE568)
  5. 7-AAD (Biolegend, catalog number: 420404, 50 µg/ml)
  6. HBSS (Corning, catalog number: 26616008)
  7. MSC消化酶 (見溶液配方)
  8. 磷酸緩沖液 (1x PBS) (見溶液配方)   
  9. 9.紅細胞裂解液 (500 ml) (見溶液配方)

儀器設備

  1. 離心機 (Eppendorf, catalog numbers: 5804R, 5424R)
  2. 移液器
  3. 水浴鍋
  4. 恒溫搖床
  5. 搖床
  6. 流式細胞儀 (Thermo fisher scientific, Attune NxT)    

實驗步驟

  1. 37 °C水浴預熱MSC消化酶 (配制方法見“溶液配方”部分),37 °C預熱搖床,冰上預冷PBS + 2% FBS。
  2. 頸椎脫臼處死小鼠,從下腹部剪開小鼠腿部皮膚,小心剪開髖關節與踝關節,將小鼠腿部完整取出,分離肌肉,取出股骨與脛骨,浸泡在預冷的PBS + 2% FBS中,置于冰上。 
  3. 骨髓、骨內膜MSC取材

    3.1

    骨髓MSC取材:小心沿骨骺剪開松質骨部分 (圖1,沿虛線部分剪開),用1 ml注射器吸取0.5 ml預冷的PBS + 2% FBS,將骨髓組織完整沖出至1.5 ml EP管中,1條股骨與1條脛骨骨髓置于同一個EP管中,冰上靜置5 min,吸去多余PBS。每管骨髓組織加入750 μl預熱的MSC消化酶,輕顛倒后置于37 °C水浴鍋中10 min,期間拿起顛倒數次。

    2

    骨內膜MSC取材:沖出骨髓后剩下的1條股骨與1條脛骨骨組織置于PBS + 2% FBS中,仔細剪碎骨組織,剪碎至骨髓腔*暴露,且碎片面積小于5 mm2 (圖2),將骨組織置于750 μl預熱的MSC消化酶中,輕顛倒后置于37 °C水浴鍋中10 min,期間拿起顛倒數次。

  4. 將上述骨髓組織或骨組織與消化酶的混合物側放于37 °C 160~220 rpm搖床中,消化20 min。
  5. 消化后室溫靜置5 min,取上清約700 μl消化液加入至10 ml預冷PBS + 2% FBS進行中和,注意不要吸取未消化的骨髓組織。
  6. 骨髓組織或骨組織中再加入750 μl預熱的MSC消化酶,重復第4、5步進行第2次消化,消化后盡量吸凈消化液,加入至第5步的中和后消化液中。
  7. 將2次消化后的中和后消化液于4 °C 500 x g離心5 min,棄去上清,每管加入1 ml紅細胞裂解液,重懸骨髓組織,用移液槍輕柔吹打均勻,37 °C靜置5 min后加入10 ml的預冷的PBS + 2% FBS終止裂解,每管細胞準備1個新的50 ml離心管,將1個70 μm濾器置于離心管上,將上述終止裂解后的11 ml細胞懸液分次傾倒至濾器中,過濾至50 ml離心管中。4 °C 500 x g離心5 min,棄去上清。
  8. 用適當體積預冷的PBS + 2% FBS重懸沉淀,用細胞計數板或流式細胞儀進行細胞計數。
  9. 取3份3 × 106細胞,調整至150 μl體積,加入2 μl (0.5 mg/ml) Purified CD16/32,置于冰上、80 rpm搖床上封閉30 min。
  10. 其中1份細胞封閉后各加入1 μl以下抗體:Ter-119-APC,CD45-APC,Pdgfrα-SuperBright 436,LepR-biotin,加入0.2 μl CD31-PE/Cy7;1份細胞封閉后加入1 μl以下抗體:Ter-119-APC-iso,CD45-APC-iso,Pdgfrα-SuperBright 436,LepR-biotin; 另1份細胞封閉后加入1 μl以下抗體:Ter-119-APC,CD45-APC,Pdgfrα-SuperBright 436-iso,LepR-biotin-iso。以上3份細胞避光置于冰上、80 rpm搖床上孵育1 h。
  11. 分別加入1 ml PBS + 2% FBS終止染色,500 x g離心5 min,棄去上清,150 μl預冷的PBS + 2%FBS重懸,加入1 μl (0.2 mg/ml) Streptavidin- APC/Cy7,置于冰上、80 rpm搖床上孵育30 min。
  12. 分別加入1 ml PBS + 2% FBS終止染色,500 x g離心5 min,棄去上清,400 μl預冷的PBS + 2% FBS重懸,每管加入5 μl (50 µg/ml) 7-AAD,混勻后使用流式細胞儀收集數據。

       結果與分析

小鼠骨髓MSCs在Pdgfrα+和LepR+的細胞中富集,也有部分骨髓來源的MSC表達CD51,并且上述3個標記物有較高的共表達比例 (Morikawa等,2009; Zhou等,2014; Yue等,2016)。還有報道發現,Nestin-GFP (Mendez-Ferrer等,2010),Gli1-cre (Zhao等,2014; Schneider等,2017),Gremlin 1 (Worthley等,2015) 和N-cadherin (Zhao等,2019) 可富集骨髓MSCs,但這些分子標記物需要依賴熒光報告工具小鼠,故在此不介紹具體方法。在此,我們使用的小鼠骨髓和骨內膜間充質干細胞的標志為CD45-Ter-119- CD31- LepR+或CD45- Ter-119-CD31- Pdgfrα+圖3為同型對照的結果及劃門標準,圖4和圖5分別為骨髓和骨內膜間充質干細胞分析流式圖和劃門方法。首先以FSC-A 和SSC-A 為軸,劃出主要細胞群,然后以FSC-A 和FSC-H去除黏連細胞,劃出單個細胞群,再根據7-AAD劃出活細胞群(7-AAD-)。接下來根據實驗需要劃出CD45- Ter-119- CD31- LepR+和CD45- Ter-119- CD31- Pdgfrα+細胞群,由流式結果可以得出,在骨髓和骨內膜MSC中LepR和Pdgfrα均有較高的共表達比例。

圖1. 小鼠股骨 (左)與脛骨 (右),虛線表示剪開的地方

圖2. 骨內膜MSC取材示意圖

圖3. LepR 與Pdgfrα同型對照結果及劃門標準

圖4. 小鼠骨髓間充質干細胞分析流式圖

圖5. 小鼠骨內膜間充質干細胞分析流式圖

失敗經驗

骨髓組織未被消化:

  1. 消化酶活性喪失。
    *MSC消化酶配好后-20 °C冰箱保存,盡快使用。
  2. 消化未在37 °C 160~220 rpm搖床中進行。
    *需保證震蕩的轉速達160~220 rpm及消化時溫度維持至37 °C。

    無明顯MSC分群:

  3. 消化過度或不足。
    *適當調整消化時間,消化骨髓組織時消化至沒有肉眼可見骨髓組織為宜。
  4. 消化酶活性不足。
    *Liberase干粉-20 °C冰箱保存,MSC消化酶配好后-20 °C冰箱保存,盡快使用。
    *MSC消化酶使用前需在37 °C先預熱,加入骨髓組織后先在37 °C水浴鍋中孵育10 min,搖床需提前設定37 °C,保證震蕩消化時溫度維持至37 °C。
  5. DNaseI 未添加或濃度不夠。
    *DNaseI的作用為消化細胞破裂后釋放的游離DNA,過多的游離DNA會纏繞細胞,導致消化不充分。但不同批號DNaseI的質量與活性單位的換算比例不同,此處使用Roche公司DNaseI (10104159001)。
  6. 使用了無鈣離子的HBSS。
    *DNaseI 需在鈣離子存在下發揮消化作用,故需使用添加了鈣離子的HBSS。
  7. 一抗或二抗濃度過低。
    *適當提高抗體濃度。
  8. 抗體孵育時間過短。
    *適當延長孵育時間。
  9. 置于室溫孵育。
    *置于室溫孵育易導致非特異結合增加,應置于冰上搖床孵育。
  10. 置于4 °C冰箱靜置孵育。
    *應在約80 rpm搖床中孵育。

溶液配方

  1. MSC消化酶
    Liberase 5 mg
    DNaseI 250 μl (20 mg/ml) 溶于25 ml HBSS
    -20 °C保存
  2. 磷酸緩沖液 (1x PBS)
    使用去離子水稀釋PBS (10x) (去除鈣、鎂離子) 至1x
  3. 紅細胞裂解液 (500 ml)
    氯化銨4.15 g
    碳酸氫鈉500 mg
    EDTA (粉末)18.5 mg
    使用去離子水定容至500 ml,4 °C保存

參考文獻

  1. Morikawa,S.,Mabuchi,Y.,Kubota,Y.,Nagai,Y.,Niibe,K.,Hiratsu,E.,Suzuki,S.,Miyauchi-Hara,C.,Nagoshi,N.,Sunabori,T.,Shimmura,S.,Miyawaki,A.,Nakagawa,T.,Suda,T.,Okano,H. and Matsuzaki,Y. (2009). Prospective identification,isolation,and systemic transplantation of multipotent mesenchymal stem cells in murine bone marrow. J Exp Med 206(11): 2483-2496.
  2. Mendez-Ferrer,S.,Michurina,T. V.,Ferraro,F.,Mazloom,A. R.,Macarthur,B. D.,Lira,S. A.,Scadden,D. T.,Ma'ayan,A.,Enikolopov,G. N. and Frenette,P. S. (2010). Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature 466(7308): 829-834.
  3. Schneider,R. K.,Mullally,A.,Dugourd,A.,Peisker,F.,Hoogenboezem,R.,Van Strien,P. M. H.,Bindels,E. M.,Heckl,D.,Busche,G.,Fleck,D.,Muller-Newen,G.,Wongboonsin,J.,Ventura Ferreira,M.,Puelles,V. G.,Saez-Rodriguez,J.,Ebert,B. L.,Humphreys,B. D. and Kramann,R. (2017). Gli1(+) mesenchymal stromal cells are a key driver of bone marrow fibrosis and an important cellular therapeutic target. Cell Stem Cell 20(6): 785-800 e788.Worthley,D. L.,Churchill,M.,Compton,J. T.,Tailor,Y.,Rao,M.,Si,Y.,Levin,D.,Schwartz,M. G.,Uygur,A.,Hayakawa,Y.,Gross,S.,Renz,B. W.,Setlik,W.,Martinez,A. N.,Chen,X.,Nizami,S.,Lee,H. G.,Kang,H. P.,Caldwell,J. M.,Asfaha,S.,Westphalen,C. B.,Graham,T.,Jin,G.,Nagar,K.,Wang,H.,Kheirbek,M. A.,Kolhe,A.,Carpenter,J.,Glaire,M.,Nair,A.,Renders,S.,Manieri,N.,Muthupalani,S.,Fox,J. G.,Reichert,M.,Giraud,A. S.,Schwabe,R. F.,Pradere,J. P.,Walton,K.,Prakash,A.,Gumucio,D.,Rustgi,A. K.,Stappenbeck,T. S.,Friedman,R. A.,Gershon,M. D.,Sims,P.,Grikscheit,T.,Lee,F. Y.,Karsenty,G.,Mukherjee,S. and Wang,T. C. (2015). Gremlin 1 identifies a skeletal stem cell with bone,cartilage,and reticular stromal potential. Cell 160(1-2): 269-284.
  4. Yue,R.,Zhou,B. O.,Shimada,I. S.,Zhao,Z. and Morrison,S. J. (2016). Leptin receptor promotes adipogenesis and reduces osteogenesis by regulating mesenchymal stromal cells in adult bone Marrow. Cell Stem Cell 18(6): 782-796.
  5. Zhao,H.,Feng,J.,Seidel,K.,Shi,S.,Klein,O.,Sharpe,P. and Chai,Y. (2014). Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell 14(2): 160-173.Zhao,M.,Tao,F.,Venkatraman,A.,Li,Z.,Smith,S. E.,Unruh,J.,Chen,S.,Ward,C.,Qian,P.,Perry,J. M.,Marshall,H.,Wang,J.,He,X. C. and Li,L. (2019). N-cadherin-expressing bone and marrow stromal progenitor cells maintain reserve hematopoietic stem cells. Cell Rep 26(3): 652-669 e656.
  6. Zhou,B. O.,Yue,R.,Murphy,M. M.,Peyer,J. G. and Morrison,S. J. (2014). Leptin-receptor-expressing mesenchymal stromal cells represent the main source of bone formed by adult bone marrow. Cell Stem Cell 15(2): 154-168.

    Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.

    引用格式:謝嘉怡, 王瑨, 趙萌. (2019). 小鼠骨髓與骨內膜間充質干細胞分析. Bio-101: e1010338. DOI:10.21769/BioProtoc.1010338.
    How to cite: Xie, J. Y. Wang,J. and Zhao, M. (2019). Flow Cytometry Analysis of Mouse Bone Marrow and Endosteum Mesenchymal Stromal Cells. Bio-101: e1010338. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010338.

 

 

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