熟妇高潮喷沈阳45熟妇高潮喷_人妻丰满熟妇av无码区乱_黑人人妻AV一区二区三_少妇太爽丰满一区二区

當前位置:首頁 > 技術文章 > 細菌的流式檢測

細菌的流式檢測

更新時間:2018-12-27瀏覽:3207次

細菌的流式檢測
Flow Cytometric Analysis of Bacteria  

摘要:傳統的細菌檢測 (如平板法和顯微技術) 耗時長、誤差大、操作繁瑣并且無法提供細菌種屬和生物學狀態信息。近年來,隨著熒光染料、結構光學和流式細胞檢測儀自身的不斷發展,利用流式細胞術 (FCM) 檢測細菌等微生物成為可能。與傳統細菌檢測方法相比,FCM具有靈敏、快速、精確、高效的優勢,同時結合其多參數數據采集特點,FCM可提供多種細菌的生物學信息,在實驗室研究、臨床診斷、工業生產、環境監測等眾多領域具應用前景。本方案以污水中的大腸桿菌( E. coli )為例,介紹如何利用FCM分析零價鐵基微球 (A-mZVI) 對其滅活去污效果。

關鍵詞: 細菌, 大腸桿菌, 零價鐵基微球, 流式細胞儀

材料與試劑

  1. 零價鐵基微球 (自制)
  2. E. coli (Coli Genetic Stock Center)
  3. 無水氯化亞鐵 (FeCl2,國藥集團,catalog number: XW77589431)
  4.  乙二胺 (EDA,國藥集團,catalog number: 10009518)
  5. 硼氫化na (NaBH4,國藥集團,catalog number: 80115816)
  6. 氬氣 (武漢祥云化工有限公司)
  7. 無水乙醇 (EtOH,國藥集團,catalog number: XW00641752)
  8. 去離子水 (18.2 MΩ•cm,由Milli-Q Gradient System制取)
  9. LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit (Invitrogen, L-13152)
  10. 0.85% NaCl緩沖液
  11. LB培養基
  12. PBS溶液

    儀器設備

  13.  高壓滅菌鍋 (Zealway)
  14.  N52 NdFeB磁鐵 (K&J Magnetics)
  15. 流式細胞儀 (BD, model: FACS AriaⅢ)
  16. 恒溫振蕩器 (倍英,model: THZ-D)
  17. 細菌培養箱
  18. 比濁儀 (上海昕瑞,model: WGZ-2XJ)
  19. 隔水式恒溫培養箱 (GNP-9160)
  20.  離心機
  21. 低溫冰箱

    軟件

  22. FlowJo軟件
  23. 實驗步驟

    一、 零價鐵基微球 (A-mZVI) 的制備

  24. 氬氣氛圍下,將75 ml 0.9 M的EDA加入到300 ml的FeCl2水溶液中 (0.075 mol/L) 中,劇烈攪拌3分鐘。
  25. 往上述溶液中加入75 ml 1.6 M的NaBH4水溶液,繼續攪拌25分鐘,直至溶液中不再有氣泡產生為止。
  26. 離心收集黑色沉淀 (4,000 × g, 30 min), 先后用去離子水和無水乙醇反復洗滌三次,經紅外燈干燥后獲得終產物 (A-mZVI)。

    二、 含E. coli污水的制備

  27.  將 -70 °C冷凍干燥保存的E. coli菌株接種于高壓蒸汽處理過的LB培養基中,置于37 °C恒溫培養箱中繼續過夜。
  28. 利用比濁儀 (OD600) 檢測細菌是否處于對數生長期 (OD值為0.35~0.6之間)。
  29. 將處于對數生長期的細菌離心分離 (10,000 × g,10分鐘),洗滌3次后重懸于0.85% NaCl的水溶液中。

  30. 三、 流式細胞術分析A-mZVI對E. coli的滅菌效果

  31.  取一定量的A-mZVI與50 ml含E. coli的菌液共孵育。
  32. 在不同時間間隔,取5 ml上述混合液,通過N52 NdFeB磁鐵分離后取出上清液,用于后續流式分析其中E. coli的數量和存活狀態。
  33. 樣本用LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit進行染色處理。按照廠家說明書將試劑盒中組分A: SYTO 9 (3.34 mM) 和組分B: PI (20 mM) 按照1:1比例混合于適當體積的無菌PBS溶液中,搖勻,取0.8 ml上述混合液加到含E. coli的上清液中,在黑暗環境下室溫孵育15 min,無菌PBS洗滌3次后重懸于0.5 ml無菌PBS溶液中,完成實驗組樣本的制作。
  34. 取未經A-mZVI處理的菌體PBS懸液不進行任何染色,作為雙陰性對照;未經處理的細菌生物用SYTO 9單獨染色作為單陽性對照,75%酒精處理30 min的細菌用PI單獨染色作為另一單陽性對照。
  35. FCM檢測:FCM檢測光源為氬燈 (激發光波長488 nm)。設前向角 (FSC) 和側向角 (SSC) 的信號值為對數放大,FSC反映了細胞直徑的大小,SSC反映了細胞內顆粒的復雜程度。建立雙參數FSC/SSC散點圖和雙參數SYTO9-A/PI-A散點圖,根據其信號調節光電倍增管電壓,得到合適的FCM圖。重懸的菌液濃度為2 × 105~107個/ml,其中收集10,000個細菌作流式分析。在雙參數FSC/SSC散點圖中找到細菌集中的區域設門,圈出所需要分析的細菌。FITC通道檢測波長530/30 nm,PE通道檢測波長586/15 nm,FITC通道收集SYTO 9的綠色熒光,PE通道收集PI的紅色熒光,獲取FITC/PE散點圖,并用FlowJo軟件進行數據分析。

    結果與分析

    零價鐵 (A-mZVI) 作為一種新型處理劑常用于水處理修復,其具有鐵低價無毒、來源廣泛、制備方法簡便、反應速度較快的優勢。對于微生物污染物而言,A-mZVI可發生芬頓反應,產生具有強氧化性的活性氧自由基 (ROS),致使微生物發生氧化損傷,進而實現高效滅活的目的 (Lv等,2017;Sun等,2019)。流式細胞術 (FCM) 在污水細菌監測中具有測定精準、樣品前處理簡單、可快速的對多參數數據進行采集,以及可對多元數據進行分析等優點。因此,我們利用FCM分析模擬的污水中E. coli的數量和存活狀態,以此評價A-mZVI對E. coli的滅菌效果。如圖1所示,初始菌液 (圖1A,未經A-mZVI處理組) 中,絕大部分細菌 (90%) 處于活菌狀態,加入A-mZVI處理后,細菌存活率急劇下降。其中,加入A-mZVI處理1小時后,E. coli存活率下降至32.6% (圖1B);2小時后,E. coli存活率下降至19.5% (圖1C)。結果表明,A-mZVI具有優異的抗菌效果,且呈時間依賴性。

  36. 圖1. E. coli經LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit染色后的流式細胞分析結果. A.空白組; B. A-mZVI處理1小時; C. A-mZVI處理2小時。細胞被分為四個子集:左下、右下、左上和右上象限依次代表陰性背景、活細菌、死細菌和損傷細菌。

    失敗經驗

  37. 因細菌比較小,在流式檢測時為減少雜信號的影響,通常會加入FSC-H和FSC-A的散點圖去除黏連。
  38. 細菌濃度需要控制。實驗中,我們發現制備1 × 107個/ml濃度的細菌進行染色后,測出的流式結果比較好。
  39. 除了大腸桿菌,其他菌種 (如:乳酸菌、趨磁細菌、化膿性鏈球菌、球芽孢桿菌、草生歐文氏菌等) 也可利用流式細胞術,分析細菌濃度、細菌活力、種屬、群體分化等相關指標。

    致謝

    本文實驗方案改編自 (Sun等,2019),所述零價鐵基微球和含菌污水由華中師范大學化學學院提供,相關流式細胞檢測方法由中科院武漢病毒所分析測試中心建立并完成。

    參考文獻

  40. Lv, Y., Niu, Z., Chen, Y. and Hu, Y. (2017). Bacterial effects and interfacial inactivation mechanism of nZVI/Pd on Pseudomonas putida strain. Water Res 115: 297-308.
  41. Sun, H., Wang, J., Jiang, Y., Shen, W., Jia, F., Wang, S., Liao, X. and Zhang, L. (2019). Rapid aerobic inactivation and facile removal of Escherichia coli with amorphous zero-valent iron microspheres: indispensable roles of reactive oxygen species and iron corrosion products. Environ Sci Technol 53(7): 3707-3717.

    Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.

    引用格式:閔娟, 關武祥. (2019). 細菌的流式檢測. Bio-101: e1010317. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010317.
    How to cite: Min, J. and Guan, W. X.  (2019). Flow Cytometric Analysis of Bacteria. Bio-101: e1010317. DOI:10.21769/BioProtoc.1010317.

Contact Us
  • 聯系QQ:277124344
  • 聯系郵箱:277124344@qq.com
  • 聯系電話:19540095576
  • 聯系地址:廣州市白云區鶴正街1號中海聯8立方創意園A1棟304室

掃一掃  微信咨詢

© 2024 廣州市超博科技有限公司 版權所有  備案號:

技術支持:        GoogleSitemap

服務熱線
13760660301

微信服務號