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流式細胞術檢測細胞凋亡 (Annexin V/PI法)

更新時間:2018-12-10瀏覽:11427次

流式細胞術檢測細胞凋亡 (Annexin V/PI)

Flow Detection of Apoptosis by Annexin V/PI 

摘要:磷脂酰絲氨酸 (phosphatidylserinePS) 又稱復合神經酸,位于正常細胞膜的胞質一側,在細胞凋亡早期,PS可從細胞膜胞質側翻轉到細胞膜外表面。基于此現象,利用Ca2 +依賴性Annexin V可與PS特異性結合,且親和力高,適用于細胞凋亡早中期的檢測。PI為一種核酸染色劑,與細胞核結合將細胞核染為紅色。PI不可透過正常的細胞膜,可透過凋亡中晚期以及壞死細胞的細胞膜,適用于在排除細胞壞死的前提下細胞凋亡中晚期檢測。將Annexin VPI同時使用,通過分群表征出正常、壞死、凋亡和機械性損傷的細胞。在該實驗中,我們對HeLa細胞的對照組和H2O2誘導組進行Annexin V/PI雙標記,經流式細胞儀檢測出不同特性的細胞群。

關鍵詞: 細胞凋亡, Annexin V/PI, 流式檢測, HeLa細胞

材料與試劑

1.      5 ml流式管 (Falconcatalog number: 352008)

2.      15 ml離心管 (Falconcatalog number: 352097)

3.      HeLa細胞

4.      Annexin V-Alexa Fluor™488 (Invitrogencatalog number: A13201)

5.      PI碘化丙啶 (Sigma-Aldrichcatalog number: P4170)

6.      NaCl 

7.      Na2HPO4 

8.      KCl 

9.      KH2PO4

10.  H2O2

  1. DEME培養基
  2. HEPES
  3. CaCl2
  4. PI染色工作液 (見溶液配方)
  5. 1× Binding buffer (見溶液配方)
  6. PBS (見溶液配方)
  7. 800 μM H2O2 (見溶液配方)

儀器設備

1.      水平離心機 (BeckmanCoulter, model: Allegra X-12R)

2.      光學顯微鏡 (Olympus, model: IX73)

3.      流式細胞儀 (FACSFortessa)

實驗步驟

1.      染色前處理

1.1

將收集到的細胞,用預冷1× PBS (4 °C) 重懸一次,300 × g , 離心5分鐘,棄上清,收集細胞。

1.2

加入300 μl1× Binding Buffer重懸細胞,調整細胞濃度至1 × 106/ml

2.      Annexin V/PI染色

  1. 取流式管,按順序編好空白管,單陽管和樣本管號。流式管中分別加入經200目細胞過濾膜過濾好的100 μl細胞懸液,單陽管中分別加入5 μl Annexin V-Alexa Fluor™48810μl PI碘化丙啶輕輕混勻。
  2. 2.2
  3. 樣本管加入5 μl Annexin V-Alexa Fluor™488輕輕混勻;再加入10 μl PI碘化丙啶輕輕混勻。
  4. 2.3
  5. 室溫避光孵育10~20分鐘,加入400 μl 1× Binding Buffer,隨后置于冰浴中,上機檢測,所選通道如下:
    Alexa Fluor™488488 nm激發,采集波段530/30
    PI561 nm激發,采集波段610/20
  6.  
  7.                 圖1. 前向 (FSC) 和側向 (SSC) 圈出HeLa細胞

      

               圖2. Annexin V/PI雙標記HeLa細胞凋亡檢測

9.     
如圖1所示通過前向 (FSC) 和側向 (SSC),分別圈出的對照組和H2O2誘導組的HeLa細胞范圍有所差別。誘導凋亡組的細胞已呈現出分群的趨勢。圖2Annexin V/PI雙標記的結果,如圖2A所示對照組的HeLa細胞處于正常狀態,但也有少許凋亡晚期的細胞,原因是培養的HeLa細胞濃度過高,導致培養基里的營養消耗過快,少許細胞因饑餓發生凋亡。圖2B中顯示,經H2O2誘導HeLa細胞出現了顯著的早期凋亡現象,比例由1.06%增至7.43%;凋亡晚期的細胞比例呈明顯增長趨勢。綜上可知,雙標記方法可以準確地反映凋亡過程:Annexin V標記的單陽性細胞為凋亡早期細胞;Annexin V PI雙標記的雙陽性細胞為凋亡晚期細胞 (Koç,等,2018)PI標記的單陽性細胞為壞死細胞;兩者均未標記上的雙陰性細胞為活細胞。由此將凋亡早期細胞、凋亡晚期細胞、壞死細胞與正常細胞區別開。因此,可作為檢測細胞凋亡的好方法 (Schutte等,1998)

注意事項

1.      使用前低速離心,以免液體積存管蓋和管壁。

2.      如果用含EDTA的胰酶消化時,注意必須*清除EDTA:在標記前用1× PBS 1× Binding buffer洗滌,清除EDTA,以免殘余的EDTACa2+螯合,影響Annexin V的結合。

3.      Annexin V-Alexa Fluor™488PI是光敏物質,在操作時請注意避光。在處理和標記時,盡可能在暗處進行。在孵育階段,用鋁箔包裹容器或置于抽屜中。細胞標記后,在暗室內用顯微鏡觀察。

4.      整個操作過程動作要盡量輕柔,勿用力吹打細胞,盡量在4 °C下操作,以免影響細胞狀態。

5.      在細胞洗滌后,請盡量將上清棄凈,以免PBS殘留,有可能會影響實驗結果。

6.      為防止熒光衰變,宜在1小時內進行流式檢測。

7.      PI染色時間過長有可能造成檢測的凋亡率偏高,建議首先進行Annexin V-Alexa Fluor™488染色,可在上機前5分鐘再加入PI染色。

溶液配方

1.      PBS
NaCl 8 g
Na
2HPO4 2.9 g
KCl 0.2 g
KH
2PO4 0.2 g
溶于1L ddH2O中,調pH值為7.2~7.4
過濾滅菌
4 °C保存

2.      800 μM H2O2 
30% H2O2 2 μl溶于880 μl 1× PBS中,配成20 mM的母液
再取80 μl母液溶于2 ml DEME培養基

3.      PI染色工作液
1 mg/mL PI原液+無菌PBS1:10稀釋成100 μg/ml工作液
4 °C保存待用

4.      1× Binding buffer
10 mM HEPES
140 mM NaCl
2.4 mM CaCl
2
pH 7.4

參考文獻

1.      Koç, E. , Çelik-Uzuner, S., Uzuner, U. and Çakmak, R. (2018). The Detailed Comparison of Cell Death Detected by Annexin V-PI Counterstain Using Fluorescence Microscope, Flow Cytometry and Automated Cell Counter in Mammalian and Microalgae Cells. J Fluoresc 28(6): 1393-1404.

2.      Schutte, B., Nuydens, R., Geerts, H. and Ramaekers, F. (1998). Annexin V binding assay as a tool to measure apoptosis in differentiated neuronal cells. J Neurosci Meth 86(1): 63-69.

  1. Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
  2. 引用格式:葛靈, 王雪冬, 丁宇波, 邊瑋. (2019). 流式細胞術檢測細胞凋亡 (Annexin V/PI). Bio-101: e1010331. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010331.
    How to cite: Ge, L., Wang, X. D., Ding Y. B. and Bian, W. (2019). Flow Detection of Apoptosis by Annexin V/PI.Bio-101: e1010331. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010331.

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