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細胞增殖的流式檢測(BrdU法)

更新時間:2018-12-10瀏覽:10678次

摘要:細胞增殖是生物體的重要生命特征,細胞以分裂的方式進行增殖。研究細胞增殖,對于理解細胞發育和分化,探索腫瘤發生和治療,以及評估細胞健康狀況和藥物安全性評價等都具有重要意義。在檢測細胞增殖的多種方法中,直接測定DNA合成是一種敏感并高精度的分析方法。5--脫氧尿嘧啶核苷 (BromodeoxyuridineBrdU),是一種胸腺嘧啶核苷的類似物。當細胞處于細胞周期中的DNA合成期 (S) 時,BrdU可以摻入到新合成的DNA中。利用抗BrdU的單克隆抗體熒光染色,就可通過流式細胞術檢測BrdU的含量,從而定量細胞群體的增殖情況 (DaviesAllen, 2007)。另外,結合核酸染料測定單個細胞的DNA含量,還可以定性特定細胞在細胞周期中的具體進程。該實驗方案中,運用脫氧核糖核酸酶DNase I消化解開DNA雙鏈,使抗體與DNA鏈上的BrdU得以接近和結合。與傳統的醇固定和強酸變性處理的方法相比,該方案更溫和,可同時對細胞表面及胞內的其他標記物進行多色流式分析。

關鍵詞: 細胞增殖檢測, 細胞周期, 5--脫氧尿嘧啶核苷 (BromodeoxyuridineBrdU), 脫氧核糖核酸酶DNase I, 流式細胞術

材料與試劑

1.       15 ml離心管 (BD Falcon, catalog number: 352097)

2.      12 × 75 mm5 ml聚苯乙烯流式管 (BD Falcon, catalog number: 352008)

3.      200目過濾尼龍網

4.       0.22 μm濾器 (Pall, catalog number: 4612)

5.       HeLa細胞

6.      脫氧核糖核酸酶DNase I (Promega, catalog number: M6101)

7.      胎牛血清FBS (杭州四季青)

8.      小鼠抗BrdU單克隆抗體,克隆號Bu20a (Cell Signaling Technology, catalog number: 5292)

9.       Alexa FluorTM488標記的山羊抗小鼠IgG二抗 (Invitrogen, catalog number: A11001)

  1. 核糖核酸酶(RNase) (Roche, catalog number: 11119915001)
  2. 5--脫氧尿嘧啶核苷(BrdU) (Roche, catalog number: 10280879001)
  3. 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) (Sigma-Aldrich, catalog number: D8417)
  4. 7-氨基放線菌素 (7-AAD) (BD Pharmingen, catalog number: 559925)
  5. 皂甙Saponin (Sigma-Aldrich, catalog number: 47036)
  6. 碘化丙啶 (PI) (Sigma-Aldrich, catalog number: P4170)
  7. NaCl
  8.  KCl
  9. Na2HPO4
  10. KH2PO4
  11.  多聚甲醛 (PFA) (Sigma-Aldrich, catalog number: 76240)
  12. 1× PBS磷酸鹽緩沖液 (見溶液配方)
  13.  BrdU溶液 (見溶液配方)
  14. 10% PFA儲液 (見溶液配方)
  15. 10% Saponin儲液 (見溶液配方)
  16.  固定/通透液4% PFA/1% Saponin (見溶液配方)
  17. 通透液1% Saponin (見溶液配方)
  18.  染色緩沖液3% FBS/0.5% Saponin (見溶液配方)
  19. PI染色液 (見溶液配方)
  20. 7-AAD染色液 (見溶液配方)
  21.  DAPI染色液 (見溶液配方)

儀器設備

1.      -80 °C冰箱 (Thermo, model: 905)

2.      二氧化碳培養箱 (Heraeus, model: HERAcell 150)

3.      旋渦混勻器 (Scientific Industries, model: Vortex-Genie 2)

4.      水浴鍋 (精宏, model: DK-80)

5.      恒溫磁力攪拌器 (虹浦, model: 85-2)

6.      電子天平 (METTLER-TOLEDO, model: PB602-S)

7.      pH (METTLER-TOLEDO, model: FE-20)

8.      臺式冷凍離心機 (Eppendorf, model: 5810R,配A-4-62水平轉子)

9.      流式細胞分析儀 (BD LSRFortessa,配有355 nm/405 nm/488 nm/561 nm/638 nm五根激光器)

軟件

1.      FlowJo軟件

實驗步驟

1.      BrdU摻入
處于對數生長期的HeLa細胞,培液中加入終濃度10 μMBrdU5% CO2培養箱中繼續在37 °C下避光培養60分鐘。同時,培養一份未加入BrdU的細胞,此后的實驗處理與摻入組保持一致,作為實驗對照用于流式分析時確定BrdU的陽性圈門位置。
注:根據細胞和實驗目的不同,具體的孵育時間可為30分鐘至48小時。在不同時間點短時間摻入 (一般為30分鐘到2小時),可以分析細胞周期。長時間如24小時以上持續的BrdU摻入可以用于確定和分析處于DNA合成活躍狀態的細胞,將其與靜止期細胞區分開來,從而進行增殖細胞比例的分析。針對具體的細胞類型和狀態,BrdU的摻入濃度和培育時間需進行預實驗測試確定。實驗中,我們對生長旺盛狀態的HeLa細胞加10 μM BrdU處理一小時,摻入*。

  1. 終止摻入,收集細胞
  2. 2.1
  3. 吸凈含有BrdU的培養液,PBS清洗細胞兩次,用0.05%胰酶消化細胞,得到的單細胞懸液收集至15 ml離心管中,細胞計數確定細胞數量。
  4. 2.2
  5. 4 °C300 × g離心5分鐘,棄上清。
  6. 2.3
  7. 1× PBS重懸細胞,依據細胞數量調整重懸體積,使細胞濃度控制在約2 × 107細胞/ml
  8. 2.4
  9. 分裝細胞,每個15 ml離心管中裝50 μl細胞懸液作為一個反應體系。可選:如想對細胞表面標記進行染色可在此步進行。

1.      注:消化時不可過度吹打細胞,注意離心轉速,操作中減少細胞碎片的產生。如要做表面蛋白染色,可改用0.5 mM EDTA/PBS37 °C孵育10分鐘,再吹打細胞,以獲得單細胞懸液。做好細胞計數,確保不同處理的樣品用于流式染色的細胞數保持一致。細胞固定與通透

3.1

1 ml 1× PBS清洗細胞,4 °C300 × g離心5分鐘,棄上清。

3.2

先用旋渦混勻器中速轉動,將沉在管底的細胞輕輕重懸彈起,再逐滴加入100 μl固定/通透液,充分混勻后,置冰上避光孵育30分鐘。

3.3

清洗,加入1 ml染色緩沖液,4 °C300 × g離心5分鐘,棄上清。

可選:該步驟固定清洗后的細胞,可于4 °C避光保存,72小時內繼續后面的染色過程即可。這對實驗中需要比較加藥處理不同時間點的樣品,較為適用。
注:固定及通透步驟對于胞內染色至關重要,為確保工作溶液的穩定和實驗的重復性,推薦實驗前新鮮配制,并于4 °C避光保存。

1.      通透
細胞輕輕重懸彈起,加入100 μl通透液,充分混勻后,室溫避光孵育10分鐘。

2.      清洗
加入1 ml染色緩沖液,4 °C300 × g離心5分鐘,棄上清。

3.      二次固定
重復第3步固定與通透過程,100 μl固定/通透液,置冰上避光孵育30分鐘。同第5步方法,清洗一次。

4.      脫氧核糖核酸酶DNase I處理
細胞輕輕重懸彈起,加入500 μl DNase I反應緩沖液,充分混勻后,加入25 μl DNase I,放入37 °C水浴鍋中避光反應45分鐘。同第5步方法,清洗兩次。

  1. 一抗標記
    小鼠抗BrdU單克隆抗體1:200稀釋于染色緩沖液中。細胞輕輕重懸彈起,加入50 μl一抗反應液,充分混勻后,置冰上避光孵育45分鐘。同第5步方法,清洗兩次。
  2. 熒光二抗標記
    Alexa FluorTM488標記的山羊抗小鼠IgG二抗1:500稀釋于染色緩沖液中。細胞輕輕重懸彈起,加入50 μl二抗反應液,充分混勻后,置冰上避光孵育20分鐘。同第5步方法,清洗兩次。
  3. 核酸染料染色,檢測單個細胞的DNA含量
    細胞輕輕重懸彈起,再加入100 μl染色液,充分混勻后,室溫避光孵育30分鐘。加入0.5 ml染色緩沖液,無需清洗,樣品經200目尼龍網過濾后轉移至流式管,放置冰上,等待上機檢測。
    注:常見的DNA染料如PI7-AADDAPI,均可用來與BrdU結合分析細胞周期。這三種染料的大激發和發射波長分別為PI 538 nm/ 617 nm7-AAD 545 nm/ 650 nmDAPI 359 nm/ 461 nm。實驗設計中,可根據流式細胞儀的配置和蛋白標記物染色所用的熒光素,靈活選擇。
  4. 上機,采集流式數據分析樣本
    實驗中所用的BD LSRFortessa流式細胞分析儀,配有355 nm/405 nm/488 nm/561 nm/638 nm五根激光器。根據細胞儀配置,BrdU的信號由Alexa FluorTM488熒光信號標記,用488 nm激光器激發,采集530/30波段的信號。PI的信號,用561 nm激光器激發,采集610/20波段。7-AAD的信號,用561 nm激光器激發,采集670/30波段。DAPI的信號,用355 nm激光器激發,采集450/50波段。
    注:為確保分析精度,檢測細胞濃度應調整為0.5~2 × 106/ml,進樣速度為低速,每秒事件數不大于400,記錄總數不小于20,000細胞。分析時通過DNA染料的熒光脈沖信號的寬度和面積,區分樣本中的粘連細胞群體,程度上的減少粘連細胞的影響。DNA染料,特別是PI具有較強的粘性,樣本上機檢測之后,必須仔細清洗流式細胞儀,以免對后續的檢測造成影響。
  1. 結果與分析
  1. 流式細胞儀上采集的數據導出后,運用FlowJo軟件分析,具體流程及結果如圖1所示。

1. BrdU法檢測HeLa細胞的細胞增殖(A-C) 為沒有BrdU摻入的對照組;(D-F) 10 μM BrdU孵育60分鐘后收集的細胞。(AD) 通過前、側向散射光信號FSCSSC散點圖,排除細胞碎片,圈出主群細胞。(BE) 通過DNA染料7-AAD的熒光脈沖信號的寬度W和面積A,進一步排除樣本中的粘連體,圈出單細胞群體。(CF) 使用BrdU (對數顯示) 7-AAD (線性顯示) 的散點圖顯示細胞周期分布,實驗組 (F) 呈現典型的馬蹄形分布。通過對照 (C) 確定BrdU陽性信號的位置,可以在 (F) 上清楚的區分出G0/G1期、G2/M期和S期,S期比例體現細胞增殖的狀態,不同細胞周期的細胞分群明顯。

溶液配方

1.      1× PBS磷酸鹽緩沖液

1)

800 ml蒸餾水中溶解NaCl 8.0 gKCl 0.2 gNa2HPO4 1.44 gKH2PO4 0.24 g

2)

調節pH值到7.2~7.4

3)

加去離子水定容至1 L

4)

0.22 μm濾膜過濾后,室溫保存

2.      BrdU溶液 
BrdU
溶于1× PBS配成10 mg/ml儲液,0.22 μm濾膜過濾除菌,分裝成31 μl/管,保存于-80 °C,避免反復凍融
實驗前,于冰上解凍,每31 μl加入1 ml 1× PBS稀釋成1 mM工作液備用

  1. 10% PFA儲液 

1)

預先加熱80 ml去離子水,燒杯放于通風櫥內的磁力攪拌器上,確認水溫低于60 °C

2)

稱取10 g多聚甲醛加入熱水中,緩慢攪拌,滴加約200 μl 10 N NaOH使溶液變為堿性以助溶

3)

磁力攪拌器加熱使溶液溫度維持在50 °C左右,持續攪拌約1小時,溶液澄清,顯示PFA充分溶解

4)

停止加熱,加入10 ml 10× PBS,待溶液冷卻至室溫,加入鹽酸調整pH值至7.2~7.4,加去離子水定容到100 ml

5)

分裝成4 ml/管,凍存于-20 °C,避免反復凍融

6)

使用前,在室溫充分融化后備用

  1. 10% Saponin儲液
    用去離子水配制,0.22 μm濾膜過濾除菌,4 °C避光保存
  2. 固定/通透液4% PFA/1% Saponin
    10% PFA10% Saponin的儲液稀釋配制于1× PBS溶液中,實驗前新鮮配制,4 °C避光保存
  3. 通透液1% Saponin
    實驗前于1× PBS溶液中新鮮配制,4 °C避光保存
  4. 染色緩沖液3% FBS/0.5% Saponin
    1× PBS溶液中配制,0.22 μm濾膜過濾后備用
  5. PI染色液
    50 μg/ml PI200 μg/ml RNase1× PBS溶液中配制
  6. 7-AAD染色液
    儲液為1 mg/ml溶于DMSO4 °C避光保存
    染色時以1:1,000稀釋于1× PBS溶液
  7. DAPI染色液
    儲液為5 mg/ml溶于去離子水,4 °C避光保存
    染色時以1:1,000稀釋于1× PBS溶液
  1. 致謝
  1. 感謝中國科學院生物化學與細胞生物學研究所細胞分析技術平臺全體成員的建議和幫助。該研究受國家自然科學基金 (31401157–丁宇波) 的支持。本方法參考改編自2006年發表在Cytometry Part AEvaluation of intranuclear BrdU detection procedures for use in multicolor flow cytometry (RothaeuslerBaumgarth2006)
  1. 參考文獻
  1. Davies, D. and Allen. P. (2007). Chapter 7: DNA Analysis by Flow Cytometry. In: Flow Cytometry. Principles and Applications. Totowa, New Jersey: Humana Press. ISBN: 978-1-58829-691-7.
  2. Rothaeusler, K. and Baumgarth, N. (2006). Evaluation of intranuclear BrdU detection procedures for use in multicolor flow cytometry. Cytometry A 69(4): 249-259.

Copyright: © 2019 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.

 

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