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一文看懂線粒體膜電位、線粒體質量、線粒體ROS檢測染料及其優缺點

更新時間:2018-11-13瀏覽:9003次

 

原創: niwanmao 流式中文網 昨天

線粒體是細胞代謝的重要介質,是活性氧(ROS)的產生者和靶點,是ATP水平和鈣穩態的調節劑,也是參與氨基酸、脂質和核苷酸合成的生物合成途徑的樞紐。

線粒體存在于所有細胞中,它們的大小、形狀和數量不同,這取決于細胞、基礎組織和其他一些因素的代謝需求。考慮到它們在細胞和機體功能中的關鍵作用,在許多遺傳和非遺傳疾病以及癌癥和衰老中觀察到線粒體(mt)功能障礙并不奇怪。在絕大多數情況下,mt功能障礙的顯著特征包括mt膜電位(mtmP)、mt質量和氧化還原電位的變化。

流式細胞儀可以快速監測完整細胞中的所有這些參數,避免mt分離和/或破膜造成的假象。現在已經有許多mt特異性熒光探針,可用于測量mtmPmt質量和mtROS,見下表:

線粒體膜電位檢測原理和要點

mtmP是質子運動動力的主要組成部分,它是由mt基質泵到膜間空間的質子形成的。這種電位根據線粒體的狀態而變化,與它們合成ATP的能力有關,是細胞健康的常見指標。mt基質是負電位的,因此用于測量mtmP的染料通常是親脂性陽離子化合物,即帶正電荷的分子,它們可以跨膜而不會與膜結合,并與mtmP成正比地積聚在mt基質中。超極化線粒體能積聚更多的染料,而去極化線粒體積聚的染料較少。

通過流式細胞術評估mtmP時,必須考慮兩個要點:

首先,應仔細滴定染料濃度。高染料濃度會導致熒光猝滅,從而產生結果異常。雖然淬滅閾值因染料而異,但一般1–30 nM的濃度算足夠低,大多能避免不必要的淬滅現象。

其次,必須使用功能性對照來確保染料信號的變化能得到正確解讀,避免非特異性改變。合適的對照包括:

1.作為解偶聯劑的FCCPCCCPvalinomycin,誘導去極化。2.oligomycin,一種ATP合成酶抑制劑,誘導去極化。3.nigericinK/H+離子載體,誘導超極化

不同線粒體膜電位染料優缺點

DiOC6已廣泛用于流式細胞術研究中,但是,DiOC6作為NADH抑制劑的活性,以及對mt的毒性,強烈限制了該探針的使用。

DiOC6相似,羅丹明123Rh123)初用于不少研究,不過Rh123雖然容易進入細胞并迅速達到平衡,但不能很好地保留在里面。此外,在某些情況下,Rh123與線粒體的結合可能與線粒體能量狀態無關,這進一步限制了其使用。

四甲基若丹明乙酯(TMRE)和四甲基若丹明甲酯(TMRM)也被廣泛用于流式細胞術檢測mtmP,這些染料無毒,染色后不易淬滅,但應以相對較低的濃度使用,可以在染色后立即進行分析,無需洗滌。這兩種染料激發光均為488nm,發射波長574nm發射。通常,應準備未染色的樣品(也稱為空白樣品),以設置背景熒光的水平。因此,通過TMRETMRM分析mtmP的變化時,就被定義為給定樣品的MdFI的變化。

碳花青染料,尤其是JC-1被認為是檢測mtmP的可靠探針。JC-1具有多色熒光發射光譜,并允許對mt去極化進行比例式半定量評估。在單體狀態下,它發出綠色熒光(529 nm),而在高度依賴于mtmP的聚集狀態下,它發出橙紅色熒光(> 590 nm),在化合物誘導mtmP崩潰時,JC-1也會成為單體。這意味著,在健康細胞中,可以出現少量綠色,大多數為橙紅色熒光,線粒體去極化的細胞大多僅顯示綠色熒光。考慮到由于mtmP變化引起的熒光變化,顯示結果的j方法是指示mtmP高或低的細胞百分比,而不是綠色和橙紅色熒光之間的比率。

1993年以來,據報道,JC-1是幾種細胞類型和測定條件的可靠膜電位指示劑,并且其與其他熒光探針的兼容性也已在多色方案中得到了證明。但是,JC-1對過氧化氫敏感、光敏感以及單體與聚集體形式之間的平衡速度較慢,可能會在一定程度上限制其使用。其它類似于JC-1的還有JC-9JC-10JC-9的單體或聚集體形式在522 nm激發,分別以535635 nm發射。JC-10490 nm激發,并在520 nm(單體形式)或590 nm(聚集形式)發射。

線粒體質量檢測染料

線粒體質量可通過使用能夠結合特定mt成分的染料進行監測,而與mt極化狀態無關。因此,熒光量與mt含量成正比。Mito IDnonyl acridine orangeNAO)這兩種染料能與mt內膜的cardiolipin結合,而MitoTracker染料與mt蛋白中存在的半胱氨酸殘基的巰基反應。其中一些染料,包括MitoTracker deep red 633,也與mt蛋白形成共價鍵,因此在細胞染色后可以固定。與TMRETMRM類似的是,對于MitoTracker染料,應測量MdFI的變化。

線粒體ROS檢測染料

關于mt ROS,近開發了兩種熒光探針,分別是MitoSOXmi,以分別標記線粒體中的陰離子超氧化物和過氧化氫。

MitoSOX是氫乙啶化合物,可靶向定位到線粒體,依賴mtmP積累到線粒體中,氧化后與線粒體DNA結合后發出熒光。與其他探針類似,當使用MitoSOXmi時,必須準備足夠的陽性和陰性對照全面驗證生物系統中mt H2O2的存在。Antimycin A或阿霉素是MitoSOX染色的j陽性對照,而外源H2O2則是mi的正確陽性對照。MitoSOX染色的陰性對照是細胞可滲透的超氧化物歧化酶模擬物或mt解偶聯劑,具體取決于細胞類型。對照的其它制備形式也可以用抗氧化劑來處理,例如N-乙酰半胱氨酸或其他能大大減少自由基產生的特異性清除劑。

目前已有不少文獻通過流式細胞術對MitoSOXmi進行了測試,能選擇性定量角質形成細胞、內皮細胞、成纖維細胞和幾種癌細胞系中的mt陰離子超氧化物和mt過氧化氫,也有報道可能在同一細胞中同時使用MitoSOXmi來分析活細胞中的mt ROS

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