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干貨│Transwell 總失敗,是哪個環節出了 問題?

更新時間:2018-10-16瀏覽:1946次

                                          干貨│Transwell 總失敗,是哪個環節出了 問題? 
                                                                 作者:毛博 
Transwell 技術在細胞共培養、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲中經常被應用到,相對來說, 它的操作還是較簡單,重復性也比較好,可還是有小伙伴叫苦不迭:為啥我總是失敗呢?毛
博今天就來幫你對癥下藥,一一梳理,看看是哪出了問題。  
  
“杯子”孔徑用對了嗎? 
Transwell 技術的名稱來自于就是一個叫 Transwell 的小杯子,可以放在細胞培養板里面。有 不同形狀,不同大小,不同選擇。但無論如何,它的關鍵部分都是一樣的,那就是杯子底層
的那張膜。這張膜一般是聚碳酸酯膜,帶有微孔,孔徑大小有 0.1-12.0 µm。根據不同的實 驗需要,需要選用不同的孔徑,共培養、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多種方面的研究, 應用的孔徑是有區別的。 
 

(1).細胞共培養: 
 
將細胞 A 種于上室,細胞 B 種于下室,可以研究細胞 B 分泌或代謝產生的物質對細胞 A 的 影響。應選擇﹤3.0 µm 孔徑。因為﹤3.0 µm 孔徑,細胞不會遷徙通過。 
 
(2).細胞趨化: 
 
①細胞 B 對細胞 A 的趨化作用:將細胞 A 種于上室,細胞 B 種于下室,可以研究細胞 B 分 泌或代謝產生的物質對細胞 A 的趨化作用。 
 
②趨化因子對細胞的趨化作用:將細胞種于上室,下室加入某種趨化因子,可研究該趨化 因子對細胞的趨化作用。 
應選擇 5.0、8.0、12.0 µm 孔徑,上室細胞可穿過膜進入下室,計數進入下室的細胞量可反 映下室成分對上室細胞的趨化能力。 
 
(3).細胞遷移: 
 
上室種細胞,一般是具備遷移能力的腫瘤細胞,下室加入 FBS 或某些特定的趨化因子,腫瘤 細胞會向營養成分高的下室跑。應選擇 8.0、12.0 µm 孔徑,計數進入下室的細胞量可反映細 胞的遷移能力。 

(4).細胞侵襲: 
 
常用 8.0、12.0 µm 孔徑,原理和方法與細胞遷移實驗類似。 

檢查過程細節小紕漏 
 
① 重復使用的問題: 
 
Transwell 小室按照要求,都是一次性使用的。不過因為價格昂貴,其實洗洗泡泡還是可以重 復用的。用完后用胰酶和 75%酒精泡,室溫涼干。再次使用前用紫外里里外外都照上 30 min。 就可以啦。 
 
② 上層培養液: 
 
上層培養液采用無血清培養基,為維持滲透壓,需加入 0.05%-0.2% BSA。 

③ 下層培養液: 
 
下層培養液采用含 5%-10% FBS 的培養基,具體濃度根據細胞侵襲力而定,侵襲力弱的細 胞可適當提高 FBS 濃度。 
 
④ 細胞培養板:  
常用的細胞培養板有 6 孔板、12 孔板、24 孔板等。細胞培養板沒什么特殊要求,普通的細 胞培養板就可以。但要注意,細胞培養板應當與購買的 Transwell 小室相配套。不要一個大 一個小,不配套啊。 
 
⑤ 細胞計數:  
那么,細胞遷移到下室了,如何計數和比較呢?用 PBS 緩沖液洗細胞 1-2 次,吸盡殘余的液 體,加入甲醇固定 20 分鐘,棄固定液,加入結晶紫染液,染色 10-20 分鐘,棄染色液,用 PBS 沖洗 干凈即可。如下圖所示,哪組遷移的多,哪組遷移的少,是不是一目了然了呢?

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